Nuna†Nuna adreso: OX11 0DE, Britio, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Britio, Diamond Light Source Co., Ltd., Elektronika Biologia Bildiga Centro.
La reakcia centro lum-rikolta komplekso 1 (RC-LH1) estas la kerna fotosinteza komponanto de purpuraj fototrofaj bakterioj. Ni prezentis du krio-elektronmikroskopajn strukturojn de la RC-LH1-komplekso de *Rhodopseudomonas palustris*. La 2,65-Å rezolucia strukturo de la RC-LH114-W-komplekso konsistas el 14 subunuaj LH1-bukloj ĉirkaŭantaj RC, kiu estas interrompita de proteino W, dum la komplekso sen proteino-W estas tute RC-konsisto ĉirkaŭita de RC. Fermita 16 subunua LH1-buklo. La komparo de ĉi tiuj strukturoj provizas komprenojn pri la dinamiko de kinono en la RC-LH1-komplekso, inkluzive de antaŭe nedifinitaj konformaj ŝanĝoj dum ligado de kinono ĉe la RC QB-ejo, same kiel la loko de helpaj kinonaj liglokoj, kiuj helpas pasi ilin al RC. La unika strukturo de la W-proteino malhelpas la fermon de la LH1-buklo, tiel kreante kanalon por akceli la kinono/kinolona interŝanĝo.
La energio provizita de fotosintezo povas subteni preskaŭ ĉian vivon sur la tero, kaj ĝi havas grandan potencialon por suna bioteknologio. Dum antaŭenigado de tutmonda fotosintezo, purpuraj fototrofaj bakterioj ankaŭ montras diversajn energiajn modojn kaj metabolajn kapablojn. Ili povas eviti fotosintezon kaj kreski kiel heterotrofaj bakterioj en mallumo, povas fiksi nitrogenon kaj karbondioksidon, produkti hidrogenon kaj degradi aromajn kombinaĵojn (1-3). Por provizi energion por ĉi tiuj procezoj, lumo devas esti rapide kaj efike konvertita en kemian energion. Ĉi tiu procezo komenciĝas kiam la lum-kaptanta antenkomplekso absorbas lumon kaj transdonas la kaptitan energion al la reakcia centro (RC), tiel komencante ŝargan apartigon (4-7). La baza unuo de fotosintezo en purpuraj fototrofaj bakterioj konsistas el tipo 2 RC, ĉirkaŭita de lum-rikolta komplekso 1 (LH1), formante la kernan komplekson RC-LH1. LH1 estas formita de aro de kurbaj αβ heterodimeroj, ĉiu el kiuj ligas du bakteriajn klorofilajn (BChl) a molekulojn kaj unu aŭ du karotenoidojn (8-12). La plej simpla LH1-anteno konsistas el 16 aŭ 17 αβ heterodimeroj ĉirkaŭantaj RC (9-13) en fermita buklo, sed en aliaj kernaj kompleksoj, transmembranaj peptidoj interrompas la kontinuecon de la ĉirkaŭa LH1, tiel antaŭenigante la kinolon/kinonan difuzon inter RC kaj citokromo bc1-komplekso (11, 13-15). La purpura fototrofa planto Rhodopseudomonas (Rps.) estas modelorganismo, kiu povas kompreni la energion kaj elektronan translokigon, kiu subtenas fotosintezon. La unua kristala strukturo de Rps. La modelo de la palustris RC-LH1-komplekso estas RC, ĉirkaŭita de 15 heterodimeraj LH1-bukloj, kiuj estas interrompitaj de nekonata proteino nomata "Proteino W" (14). Proteino-W poste estis identigita kiel RPA4402, kiu estas nekarakterizita 10.5kDa proteino kun tri antaŭdiritaj transmembranaj helicoj (TMH) (16). Ni proponas renomi la genon rpa4402, kiu kodas proteinon W, al pufW por kongrui kun la nomenklaturo uzata por genoj kodantaj subunuojn RC-L, M (pufL, pufM) kaj LH1α, β (pufA, pufB). Interese, proteino-W ĉeestas nur en ĉirkaŭ 10% de RC-LH1, rivelante ke Rps. palustris produktas du malsamajn RC-LH1-kompleksojn. Ĉi tie, ni raportas la alt-rezoluciajn krio-EM (cryo-EM) strukturojn de du kernaj kompleksoj, unu kun proteino W kaj 14 αβ heterodimeroj, la alia sen proteino W kaj fermita LH1-buklo kun 16 Heterodimeroj. Nia strukturo reprezentas ŝanĝon en la kompreno de la RC-LH1-komplekso de Rps. palustris, ĉar ni analizis la homogenan populacion de ĉiu variaĵo kaj havas sufiĉan rezolucion por klare asigni ĉiun peptidon kaj ligitajn pigmentojn kaj rilatajn lipidojn kaj kinonojn. La komparo de ĉi tiuj strukturoj montras, ke la tri TMH-proteinoj-W, kiuj ĝis nun ne estis trovitaj en iu ajn alia RC-LH1-komplekso, generas kinonan kanalon por akceli la kinono/kinolona interŝanĝon. Kelkaj konservitaj lipidaj kaj kinonaj liglokoj estis identigitaj, kaj ni rivelis novan konforman ŝanĝon post la kombinaĵo de kinono kaj RC, kiu povus esti taŭga por fotosistemo II (PSII) RC de oksigenitaj fototrofaj organismoj. Niaj rezultoj provizas novajn komprenojn pri la kinetiko de kinono/kinolona ligado kaj interŝanĝo en la RC-LH1-kerna komplekso de purpuraj fototrofaj bakterioj.
Por faciligi detalan studon de la du kompleksoj trovitaj en Rps. palustris, ni izolas ĉiun RC-LH1 per biokemiaj metodoj. La proteino W-manka komplekso (ĉi-poste nomata ΔpufW) estis purigita de la trostreĉo sen la pufW-geno (16), kaj nur unu RC-LH1-komplekso povas esti produktita. La proteino W-entenanta komplekso estas produktita de unu trostreĉo. La proteino W de ĉi tiu trostreĉo estas modifita per 10x His-etikedo ĉe ĝia C-finaĵo, tiel ke la proteino W-entenanta komplekso povas esti efike kombinita kun plejparto de mankanta proteino W per senmovigado de metalo. La komplekso estas efike apartigita (16) per Afineca Kromatografio (IMAC).
Kiel montrite en Figuro 1, ambaŭ kompleksoj enhavas tri-subunuan RC (RC-L, RC-M kaj RC-H) ĉirkaŭatan de LH1-anteno. La 2.80-A strukturo de la komplekso sen proteino-W montras 16 αβ heterodimerojn, formante fermitan LH1-buklon tute ĉirkaŭantan RC, ĉi-poste nomata la RC-LH116-komplekso. La 2.65 Å strukturo de la proteino-W-entenanta komplekso havas 14-heterodimeron LH1 interrompitan de proteino-W, ĉi-poste nomata RC-LH114-W.
(A kaj B) Surfaca prezento de la kombinaĵo. (C kaj D) Ligitaj pigmentoj esprimitaj en bastonetoj. (E kaj F) La kompleksoj observitaj de la citoplasma surfaco havas la peptidojn kaj LH1-subunuojn reprezentitajn en bildstrioj, kaj estas numeritaj dekstrume ekde la proteino-W breĉo [kongrua kun Rba numerado. sphaeroides-komplekso (13)]. Por LH1-α, la koloro de la proteina subunuo estas flava; por LH1-β, la koloro de la proteina subunuo estas blua; por proteino-W, la proteino estas ruĝa; por RC-H, ĝi estas cejana; por RC-L, ĝi estas oranĝa; por RC-M, magenta. Kunfaktoroj estas reprezentitaj per bastonetoj, verda reprezentas BChl kaj BPh a molekulojn, viola reprezentas karotenoidojn, kaj flava reprezentas UQ10 molekulojn. (G kaj H) Pligrandigita vido de la proteino-W breĉo en la ekvivalenta regiono de RC-LH114-W komplekso (G) kaj RC-LH116 komplekso (H). Kunfaktoroj estas montrataj en la formo de spacplenigaĵo, kelatigita kinono estas montrata blue. La proteino-W-interspaco estas elstarigita per blua streketo en (G), kaj la malgrandaj truoj kie kinono/kinololo difuzas sur la LH116-ringo estas elstarigitaj per nigra streketo en (H).
Figuro 1 (A kaj B) montras la RC ĉirkaŭitan de malfermaj aŭ fermitaj aroj de LH1αβ heterodimeroj, ĉiu el kiuj ligas du BChl kaj unu karotenoidon (Figuro 1, C kaj D). Antaŭaj studoj montris, ke Rps estas la LH1-komplekso. En la biosinteza vojo de spirulina ksantino, ĉi tiuj specioj enhavas miksitajn populaciojn de karotenoidoj (17). Tamen, spiropiroksantino estas la domina karotenoido kaj ĝia denseco estas kontentiga. Tial, ni elektis modeligi spiroksantinon ĉe ĉiuj LH1-liglokoj. La alfa kaj beta polipeptidoj estas unuopaj TMH-oj kun mallongaj membranaj eksteraj regionoj (Figuro 1, A, B, E, kaj F). Kvankam la denseco de 17 restaĵoj ĉe la C-finaĵo ne estis observita, la alfa polipeptido estis fendita de Met1 al Ala46 en ambaŭ kompleksoj. β polipeptido estis reduktita de Gly4 al Tyr52 en RC-LH116, kaj de Ser5 al Tyr52 en RC-LH114-W. Neniu denseco de 3 aŭ 4 N-finaj aŭ 13 C-finaj restaĵoj estis observita (Figuro S1). Analizo per masospektrometrio de la miksita RC-LH1-komplekso preparita el la sovaĝ-tipa trostreĉo montris, ke la mankanta regiono estis la rezulto de heterologa fendado de ĉi tiuj peptidoj (Figuro S1 kaj S2). La N-fina formiligo de α-Met1 ankaŭ estis observita (f). La analizo montris, ke la α-peptido konsistas el restaĵoj fMet1 ĝis Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, kaj la β-peptido konsistas el restaĵoj Ser2 ĝis Ala53, kio bone kongruas kun la mapo de malalt-temperatura EM-denseco.
Kunordigo de α-His29 kaj β-His36 faras BChl-ojn vizaĝ-al-vizaĝe; ĉiu αβ-heterodimero kuniĝas kun siaj najbaroj por formi malferman buklon (RC-LH114-W) aŭ fermitan buklon (RC-LH116) ĉirkaŭ la eksciton-kuplita pigmenta aro (Figuro 1, C kaj D). Kompare kun la 877 nm-bendo de RC-LH114-W, la 880 nm-absorba ruĝenŝoviĝo de RC-LH116 estas 3 nm (Figuro 2A). Tamen, la cirkla dikroisma spektro estas preskaŭ la sama (Figuro 2B), indikante ke kvankam ekzistas klara diferenco inter malfermaj kaj fermitaj bukloj, la loka medio de BChl-oj estas tre simila. La absorba ruĝenŝoviĝo povas esti la rezulto de reduktita termika moviĝo kaj pliigita stabileco sur la fermita buklo (18, 19), la ŝanĝo en pigmenta kuplado kaŭzita de la fermita buklo (20, 21), aŭ kombinaĵo de ĉi tiuj du efikoj (11).
(A) Ultraviola/videbla/preskaŭ-infraruĝa absorba spektro, kies pintoj estas markitaj per siaj respondaj pigmentoj kaj normaligitaj al la BPh-pinto je 775 nm. (B) Cirkla dikroisma spektro normaligita al BChl-absorbo je 805 nm. (C kaj D) Elektitaj ΔA-spektroj el la temp-solvitaj absorbaj spektroj de RC-LH114-W-komplekso (C) kaj RC-LH116-komplekso (D). Por pli bona komparebleco, ĉiuj spektroj estas normaligitaj al ∆A de −A je 0.2 ps. (E) La rapideco de citokromo c2-oksidiĝo post surradiado en la ĉeesto de diversaj koncentriĝoj de UQ2 (vidu Figuron S8 por krudaj datumoj). (F) En ĉeloj kreskigitaj sub malalta, meza aŭ alta intenseca lumo (10, 30 aŭ 300μMm-2 s-1, respektive), la proteinaj W kaj RC-L-subunuoj en la purigita komplekso kaj la apartigita membrana proporcio. Determinu la proteinan nivelon per SDS-poliakrilamida ĝelelektroforezo kaj imunanalizo (vidu Figuron S9 por krudaj datumoj). Determinu la proporcion relativan al la purigita RC-LH114-W komplekso. La stoiĥiometria proporcio de RC-L al proteino-W de la komplekso estas 1:1.
La BChl-oj ĉe pozicio 1 en la misformita αβ14-buklo de RC-LH114-W (Figuro 1, A, C, kaj E) estas pli proksimaj al la RC-primara donanto (P) je 6.8 Å ol la ekvivalentaj BChl-oj en RC-LH116 (Figuro 1, B, D, kaj F, kaj Figuro S3); tamen, la pasema sorba kinetiko de la du kompleksoj montras, ke por RC-LH114-W kaj RC-LH116, la ekscitaj energi-transigaj tempokonstantoj de LH1 al RC estas 40 ±4 kaj 44 ±3 ps (Figuro 2). , C kaj D, Figuro S4 kaj Tabelo S2). Ankaŭ ne ekzistas signifa diferenco en elektronika transdono ene de RC (Figuro S5 kaj rilata suplementa teksto). Ni suspektas, ke la proksima korespondado de la energi-transdona tempo inter LH1 kaj RC-P ŝuldiĝas al la simila distanco, angulo kaj potenciala energio de plej multaj BChl-oj en la du LH1-bukloj. Ŝajnas, ke esplori la LH1-energian ŝablonon por atingi la minimuman distancon ne estas pli rapida ol rekta energi-transdono de suboptimalaj lokoj al RC. La malferma-cirkvita LH1-buklo en RC-LH114-W ankaŭ povas sperti nesignifan termikan moviĝon sub malaltaj temperaturkondiĉoj por struktura analizo, kaj ekzistas pli longa αβ14-ringa formo je ĉambra temperaturo laŭ la pigmenta distanco de βBChls ĉe la pozicio de RC 1.
La komplekso RC-LH116 enhavas 32 BChl-ojn kaj 16 karotenoidojn, kaj ĝia ĝenerala aranĝo estas la sama kiel tiu akirita de Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 trostreĉo (PDB ID 7C9R) (12) kaj verdaj algoj (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Post vicigo, nur malgrandaj devioj en la pozicioj de αβ heterodimeroj estis observitaj, precipe 1-5, 15, kaj 16 (Figuro S6). La ĉeesto de proteino-W havas signifan efikon sur la strukturo de LH1. Ĝiaj tri TMH-oj estas konektitaj per mallongaj bukloj, kun la N-terminalo sur la lumena flanko de la komplekso kaj la C-terminalo sur la citoplasma flanko (Figuroj 1A kaj 3, A ĝis D). Proteino-W estas plejparte hidrofoba (Figuro 3B), kaj TMH2 kaj TMH3 interagas kun LH1αβ-14 por formi transmembranan surfacon (Figuro 3, B kaj E ĝis G). La interfaco konsistas ĉefe el Phe, Leu kaj Val restaĵoj en la transmembrana regiono. Ĉi tiuj restaĵoj estas stakigitaj kun hidrofobaj aminoacidoj kaj αβ-14 pigmentoj. Kelkaj polusaj restaĵoj ankaŭ kontribuas al la interagado, inkluzive de la hidrogena ligo inter W-Thr68 kaj β-Trp42 sur la surfaco de la kompleksa kavaĵo (Figuro 3, F kaj G). Sur la citoplasma surfaco, Gln34 estas apud la keto-grupo de αβ-14 karotenoidoj. Krome, la n-dodecila β-d-maltozida (β-DDM) molekulo estis solvita, kaj ĝia hidrofoba vosto etendiĝis al la interfaco inter proteino-W kaj αβ-14, kaj la lipida vosto eble troviĝas en la korpo. Ni ankaŭ rimarkis, ke la C-finaj rezoluciaj regionoj de proteino W kaj RCH estas tre proksimaj, sed ne ene de la ebleco formi specifajn interagojn (Figuro 1, A kaj E). Tamen, povas esti interagoj en la nesolvitaj C-finaj aminoacidoj de ĉi tiuj du proteinoj, kiuj povas provizi mekanismon por la rekrutado de proteino-W dum la kunmeto de la RC-LH114-W komplekso.
(A) Proteino-W, kiu frontas la interfacon kun LH1αβ14 en bildstria formo, havas bastonforman flankan ĉenon (ruĝan), montratan en parto de la elektrostatika potenciala diagramo (travidebla griza surfaco kun konturnivelo de 0.13). (B) Proteino-W reprezentita per hidrofoba kolora surfaco. Polusaj kaj ŝargitaj areoj estas montrataj cejane, hidrofobaj areoj estas montrataj blanke, kaj forte hidrofobaj areoj estas montrataj oranĝe. (C kaj D) Proteino-W reprezentita bildstrie, ĝia orientiĝo estas la sama kiel en (A) (C), kaj rotaciita je 180° (D). Laŭ la pozicio en la sekvenco, la distingeblaj restaĵoj alprenas ĉielarkan kolorskemon, kie la N-terminalo estas blua kaj la C-terminalo estas ruĝa. (E) Proteino-W en la sama vido kiel en (A), kaj la restaĵoj ĉe la interfaco de proteino-W:LH1 estas reprezentitaj per bastonetoj kun alkroĉitaj markoj. (F) Proteino-W estas rotaciita 90° rilate al (E) kaj LH1αβ14 en la desegnofilma prezento, kaj rilate al la interfacaj restaĵoj en la stangeta prezento. La elstarantaj restaĵoj de la beta-polipeptido estas etikeditaj. La kofaktoro estas montrita kiel stango kongruanta kun la koloro de Figuro 1, la malkomponita β-DDM estas montrita grize, kaj la oksigeno estas montrita ruĝe. (G) La vido en (F) estas rotaciita 180°, kun la elstaraj restaĵoj de la etikedita alfa-polipeptido.
Proteino-W anstataŭigas αβ-heterodimeron (la 15-an en Figuro 1F), tiel malhelpante fermon de buklo kaj klinante la unuajn tri αβ-heterodimerojn. Oni observis, ke la maksimuma inklinangulo de la unua αβ-1 heterodimero rilate al la normalo de la filmo estis 25° ĝis 29° (Figuro 1, A kaj E), kiu estis formita per la 2° ĝis 8° inklino de αβ-1 en RC A akra kontrasto-LH116 (Figuro 1, B kaj F). La dua kaj tria heterodimeroj estas klinitaj je 12° ĝis 22° kaj 5° ĝis 10°, respektive. Pro la stera malhelpo de RC, la klino de αβ-1 ne inkluzivas la duan paron de αβ (kiu respondas al la 16-a αβ en Figuro 1F), tiel formante klaran breĉon en la LH1-ringo (Figuro 1, A kaj E). Pro la manko de du αβ-heterodimeroj, akompanata de la perdo de kvar BChl kaj du karotenoidoj, neniu el la karotenoidoj ligiĝas al la tordita αβ-1 subunuo, rezultante en LH114-W-ringo enhavanta 13 karotenoidojn (Vegetarian) kaj 28 BChl-ojn. La lokaj rezoluciaj taksoj de la du kompleksoj en la regionoj αβ1 ĝis 7 estas pli malaltaj ol tiuj de la resto de la LH1-buklo, kio povas reflekti la enecan plastikecon de la LH1-subunuo apud la RC QB-ejo (Figuro 4).
La bildoj de RC-LH114-W (A kaj B) kaj RC-LH116 (C kaj D) estas montritaj el la sama supra/flanka vido (A kaj B) (A kaj C) kaj kavaĵa surfaco de Fig. 1. (B kaj D). La koloraj klavoj estas montritaj dekstre.
La sola alia karakteriza kerna komplekso kun stoiĥiometria proporcio de 1:14 estas la dimero Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Tamen, proteino W kaj PufX ne havas evidentan homologion, kaj havas signifan efikon sur siaj respektivaj LH1-strukturoj. PufX estas ununura TMH kun N-fina citoplasma domajno kiu interagas kun la citoplasma flanko de la RC-H-subunuo (13) ĉe pozicio korespondanta al Rps. palustris LH116αβ-16. PufX kreas kanalon por la kinono/kinolona interŝanĝo inter RC-LH1 kaj la citokroma bcl-komplekso kaj ĉeestas en ĉiuj Rba. sphaeroides kerna komplekso (13). Kvankam la monomero-monomera interfaco estas en Rba. La sferoida dimero RC-LH1-PufX situas ĉe la ligpozicio de proteino W en RC-LH114-W, kaj la breĉo induktita de PufX kaj proteino-W estas ĉe ekvivalenta pozicio (Figuro S7A). La breĉo en RC-LH114-W ankaŭ estas akordigita kun la hipoteza kinona kanalo (8) de Pseudomonas rosea LH1, kiu estas formita de peptidoj ne rilataj al proteino W aŭ PufX (Figuro S7B). Krome, la kinona kanalo en Blc. La smeraldverda LH1 formita per ekskludo de unu γ subunuo (7) situas en simila pozicio (Figuro S7C). Kvankam mediaciita de malsamaj proteinoj, la apero de ĉi tiuj kinono/kinololaj kanaloj en komuna pozicio en la RC-LH1-komplekso ŝajnas esti ekzemplo de konverĝa evoluo, indikante ke la breĉo kreita de proteino W povas agi kiel kinona kanalo.
La breĉo en la LH114-W buklo permesas la formadon de kontinua membranregiono inter la interna spaco de la RC-LH114-W komplekso kaj la ĉefa membrano (Figuro 1G), anstataŭ konekti la du domajnojn per proteina poro kiel en proteinoj. La RC-LH116 komplekso similas al fermita Tch. pinglosimila komplekso (22) (Figuro 1H). Ĉar la difuzo de kinono tra la membrano estas pli rapida ol la difuzo tra la mallarĝa proteina kanalo, la malferma LH114-W buklo povas permesi pli rapidan RC-trafluon ol la fermita LH116 buklo, kaj la difuzo de kinono en la RC povas esti pli limigita. Por testi ĉu proteino W influas la konvertiĝon de kinonoj tra RC, ni faris citokroman oksidigan analizon sur certa koncentriĝo de ubikinono 2 (UQ2) (analogo de natura UQ10 kun pli mallonga izoprena vosto) (Figuro 2E). Kvankam la ĉeesto de kelatigita kinono malhelpas la precizan determinadon de la ŝajna konstanto de Michaelis (RC-LH114-W kaj RC-LH116 taŭgas por 0,2 ± 0,1 μM kaj 0,5 ± 0,2 μM, respektive), la maksimuma rapideco de RC-LH114-W (4,6 ± 0,2 e-RC-1 s-1) estas 28 ± 5% pli granda ol tiu de RC-LH116 (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1).
Ni komence taksis, ke proteino-W ĉeestas en proksimume 10% de la kerna komplekso (16); ĉi tie, la okupo-procentoj de kreskoĉeloj en malalta lumo, meza lumo kaj alta lumo estas 15±0.6%, 11±1% kaj 0.9±0.5, respektive (Figuro 2F). Kvanta komparo de mas-spektrometrio montris, ke la aldono de histidina etikedo ne reduktis la relativan abundon de proteino-W kompare kun sovaĝtipaj trostreĉoj (P = 0.59), do ĉi tiuj niveloj ne estas artefakto de modifita proteino-W (Figuro S10). Tamen, ĉi tiu malalta okupo de proteino-W en la RC-LH1-komplekso povas permesi al iuj RC-oj ŝanĝiĝi je akcelita rapideco, tiel mildigante la pli malrapidan interŝanĝon de kinono/kinolono en la RC-LH116-komplekso. Ni rimarkis, ke la alta lum-okupo-procento estas malkongrua kun lastatempaj transkriptomikaj datumoj, kiuj indikas, ke pufW-gena esprimo pliiĝas sub forta lumo (Figuro S11) (23). La diferenco inter pufW-transskribo kaj proteino-W-enkorpigo en la RC-LH1-komplekson estas konfuza kaj povas reflekti la kompleksan reguligon de la proteino.
En RC-LH114-W, 6 kardiolipino (CDL), 7 fosfatidilkolino (POPC), 1 fosfatidilglicerolo (POPG) kaj 29 β-DDM-molekuloj estas asignitaj kaj modelitaj en ĝi: 6 CDL-oj, 24 POPC-oj, 2 POPG-oj kaj 12 βDDM-oj. RC-LH116 (Figuro 5, A kaj B). En ĉi tiuj du strukturoj, CDL preskaŭ situas sur la citoplasma flanko de la komplekso, dum POPC, POPG kaj β-DDM plejparte situas sur la lumena flanko. Du lipidaj kaj lesivaj molekuloj estis izolitaj en la αβ-1 ĝis αβ-6 regiono de la RC-LH114-W komplekso (Figuro 5A), kaj kvin estis izolitaj en la ekvivalenta regiono de RC-LH116 (Figuro 5B). Pli da lipidoj estis trovitaj sur la alia flanko de la komplekso, ĉefe CDL, akumulita inter RC kaj αβ-7 ĝis αβ-13 (Figuro 5, A kaj B). Aliaj strukture solvitaj lipidoj kaj lesivoj troviĝas ekster la LH1-ringo, kaj bone solvitaj acilĉenoj etendiĝas inter LH1-subunuoj, prove nomitaj kiel β-DDM en RC-LH114-W, kaj difinitaj kiel β-DDM en RC. Miksaĵo de β-DDM kaj POPC-LH116. La similaj pozicioj de kelatantaj lipidoj kaj lesivoj en nia strukturo indikas, ke ili estas fiziologie signifaj liglokoj (Figuro S12A). La pozicioj de ekvivalentaj molekuloj en Tch ankaŭ havas bonan konsistencon. Mild kaj Trv. Strain 970 RC-LH1-oj (Figuro S12, B ĝis E) (9, 12) kaj la hidrogenligaj restaĵoj de la lipida kapgrupo montris sufiĉe bonan konservadon en la sekvenca vicigo (Figuro S13), indikante ke Konservita CDL kiu ligiĝas al RC (24), ĉi tiuj lokoj povas esti konservitaj en la RC-LH1-komplekso.
(A kaj B) La peptidoj RC-LH114-W (A) kaj RC-LH116 (B) estas reprezentitaj per bildstrioj, kaj la pigmentoj estas reprezentitaj per bastonetoj, uzante la kolorskemon en Figuro 1. Lipidoj estas montritaj ruĝe, kaj lesivoj estas montritaj grize. UQ ligita al RC QA kaj QB lokoj estas flava, dum izolita UQ estas blua. (C kaj D) La samaj vidoj kiel (A) kaj (B), kun lipidoj preterlasitaj. (E ĝis G) Pligrandigita vido de Q1(E), Q2(F) kaj Q3(G) de RC-LH116, kun flankaj ĉenoj kiuj influas unu la alian. La hidrogenaj ligoj estas montritaj kiel nigraj streketitaj linioj.
En RC-LH116, kaj RC QA kaj QB UQ, kiuj partoprenas en elektrona translokigo en la procezo de ŝarga apartigo, estas malkomponitaj en siaj liglokoj. Tamen, en RC-LH114-W, QB-kinono ne estas solvita kaj estos detale diskutita sube. Aldone al QA kaj QB-kinonoj, du kelatitaj UQ-molekuloj (situantaj inter la RC kaj LH1-ringoj) estas asignitaj en la RC-LH114-W-strukturo laŭ iliaj bone solvitaj ĉefgrupoj (situantaj en Q1 kaj Q2, respektive). spaco). Figuro 5C). Du izoprenaj unuoj estas asignitaj al Q1, kaj la densecmapo solvas la kompletajn 10 izoprenajn vostojn de Q2. En la strukturo de RC-LH116, tri kelatitaj UQ10-molekuloj (Q1 ĝis Q3, Figuro 5D) estas solvitaj, kaj ĉiuj molekuloj havas klaran densecon tra la tuta vosto (Figuro 5, D ĝis G). En la du strukturoj, la pozicioj de la kinonaj kapgrupoj de Q1 kaj Q2 havas bonegan konsistencon (Figuro S12F), kaj ili interagas nur kun RC. Q1 situas ĉe la enirejo de la W-interspaco de RC-LH114-W (Figuro 1G kaj 5, C, D kaj E), kaj Q2 situas proksime al la QB-ligloko (Figuro 5, C, D) kaj F). La konservitaj L-Trp143 kaj L-Trp269 restaĵoj estas tre proksimaj al Q1 kaj Q2 kaj provizas eblajn π-stakigajn interagojn (Figuro 5, E kaj F, kaj Figuro S12). L-Gln88, 3.0 Å de la distala oksigeno de Q1, provizas fortan hidrogenan ligon (Figuro 5E); ĉi tiu restaĵo estas konservita en ĉiuj RC-oj krom la plej malproksima rilato (Figuro S13). L-Ser91 estas konservative anstataŭigita per Thr en plej multaj aliaj RC-oj (Figuro S13), estas 3.8 Å de la metil-oksigeno de Q1, kaj povas provizi malfortajn hidrogenajn ligojn (Figuro 5E). Q3 ŝajne ne havas specifan interagadon, sed situas en la hidrofoba regiono inter la RC-M subunuo kaj la LH1-α subunuo 5 ĝis 6 (Figuro 5, D kaj G). Q1, Q2 kaj Q3 aŭ proksimaj kelatitaj kinonoj ankaŭ estis solvitaj en Tch. Gentle, Trv. Strain 970 kaj Blc. La irisa strukturo (9, 10, 12) indikas konservitan helpkinonan liglokon en la RC-LH1-komplekso (Figuro S12G). La kvin malkomponitaj UQ-oj en RC-LH116 bone kongruas kun la 5,8 ± 0,7 de ĉiu komplekso determinita per alt-efikeca likva kromatografio (HPLC), dum la tri malkomponitaj UQ-oj en RC-LH114-W estas pli malaltaj ol la mezurita valoro de 6,2 ± 0,3 (Fig. S14) indikas, ke ekzistas nesolvitaj UQ-molekuloj en la strukturo.
La pseŭdosimetriaj L kaj M polipeptidoj ĉiu enhavas kvin TMH-ojn kaj formas heterodimeron, kiu kombinas unu BChl-dimeron, du BChl-monomerojn, du bakteriofagajn (BPh) monomerojn, kaj unu ne-heman feron kaj unu aŭ du UQ10-molekulojn. Pro la ĉeesto de hidrogenaj ligoj sur la fina ketona grupo kaj ĝia konata amasiĝo en Rps, karotenoidoj estas integritaj en la M-subunuo, kiu nomiĝas cis-3,4-dehidroorhodopino. Specioj (25). La ekstermembrana domajno de RC-H estas ankrita al la membrano per ununura TMH. La ĝenerala RC-strukturo similas al la tri-subunua RC de rilataj specioj (kiel ekzemple Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). La makrocikloj de BChl kaj BPh, la karotenoida spino kaj ne-hema fero interkovriĝas ene de la rezolucia intervalo de ĉi tiuj strukturoj, same kiel la UQ10-ĉefgrupo ĉe la QA-ejo kaj la QB-kinono ĉe RC-LH116 (Figuro S15).
La havebleco de du RC-strukturoj kun malsamaj QB-lokaj okupoprocentoj provizas novan ŝancon ekzameni la konsekvencajn konformajn ŝanĝojn akompanantajn QB-kinonan ligadon. En la RC-LH116-komplekso, QB-kinono situas en la plene ligita "proksima" pozicio (26), sed la apartigo de RC-LH114-W ne havas QB-kinonon. Ne estas QB-kinono en RC-LH114-W, kio estas surpriza ĉar la komplekso estas aktiva, pli ol la RC-LH116-komplekso kun strukture solvita QB-kinono. Kvankam la du LH1-ringoj kelatas ĉirkaŭ ses kinonojn, kvin estas strukture solvitaj en la fermita RC-LH116-ringo, dum nur tri estas strukture limigitaj en la malferma RC-LH114-W-ringo. Ĉi tiu pliigita struktura malordo povas reflekti la pli rapidan anstataŭigon de RC-LH114-W QB-ejoj, pli rapidan kinonan kinonon en la komplekso, kaj pliigitan probablecon de transiro de la LH1-buklo. Ni sugestas, ke la manko de UQ en la RC QB-ejo de RC-LH114-W povus esti la rezulto de pli kompleksa kaj pli aktiva komplekso, kaj la QB-ejo de RC-LH114-W tuj frostiĝis en la UQ-tranĉilo. La specifa stadio (la enirejo al la QB-ejo estis fermita) reflektas la formon de ĉi tiu aktiveco.
Sen QB, la akompananta rotacio de L-Phe217 al pozicio nekongrua kun la ligado de UQ10 okazas, ĉar ĝi kaŭzus spacan kolizion kun la unua izoprena unuo de la vosto (Figuro 6A). Krome, la evidentaj ĉefaj konformaj ŝanĝoj estas evidentaj, precipe la helico de (mallonga helico en la buklo inter TMH D kaj E) kie L-Phe217 estas ŝovita al la QB-liga poŝo kaj la rotacio de L-Tyr223 (Figuro 6A) rompas la hidrogenan ligon kun la M-Asp45-kadro kaj fermas la enirejon de la QB-ligloko (Figuro 6B). La helico de pivotas ĉe sia bazo, la Cα de L-Ser209 estas ŝovita je 0.33 Å, dum la L-Val221Cα estas ŝovita je 3.52 Å. Ne estas observeblaj ŝanĝoj en TMH D kaj E, kiuj estas supermeteblaj en ambaŭ strukturoj (Figuro 6A). Laŭ nia scio, ĉi tiu estas la unua strukturo en la natura RC kiu fermas la QB-ejon. Komparo kun la kompleta (QB-ligita) strukturo montras, ke antaŭ ol la kinono estas reduktita, konforma ŝanĝo estas necesa por igi ĝin eniri la kinonon. L-Phe217 rotacias por formi π-stakigan interagadon kun la kinona ĉefgrupo, kaj la helico ŝoviĝas eksteren, permesante al la skeleto de L-Gly222 kaj la flanka ĉeno de L-Tyr223 formi hidrogenligan reton kun stabila hidrogenliga strukturo (Figuro 6, A kaj C).
(A) Interkovranta bildstrio de hologramo (L-ĉeno, oranĝkolora/M-ĉeno, magenta) kaj apo-strukturo (griza), en kiu la ŝlosilaj restaĵoj estas montrataj en formo de bastonforma prezento. UQ10 estas reprezentita per flava strio. La punktita linio indikas la hidrogenajn ligojn formitajn en la tuta strukturo. (B kaj C) La surfaca prezento de la apolipoproteino kaj la tuta ringa strukturo, elstarigante la flankĉenan oksigenon de L-Phe217 blue kaj L-Tyr223 ruĝe, respektive. La L-subunuo estas oranĝkolora; la M kaj H-subunuoj ne estas koloraj. (D kaj E) Apolipoproteino (D) kaj tutaj (E) RC QB-ejoj [kolorigitaj per (A) respektive] kaj Thermophilus thermophilus PSII (verda, blua kun plasta kinono; PDB ID: 3WU2) Vicigu (58).
Neatendite, kvankam pluraj strukturoj de QB-mankhavaj RC-oj sen LH1 estas haveblaj, la konformaj ŝanĝoj observitaj en ĉi tiu studo ne estis antaŭe raportitaj. Ĉi tiuj inkluzivas la QB-malplenigan strukturon de Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) kaj Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), kiuj ĉiuj estas preskaŭ samaj kiel ilia ĝenerala QB-strukturo. Detala inspektado de 3PRC rivelis, ke LDAO (Laŭrildimetilaminaoksido) lesivaj molekuloj ligiĝas ĉe la enirejo de la QB-pozicio, kio povas malhelpi rearanĝon en fermitan konformacion. Kvankam LDAO ne putriĝas ĉe la sama pozicio en 1EYS aŭ 1OGV, ĉi tiuj RC-oj estas preparitaj uzante la saman lesivon kaj tial povas produkti la saman efikon. La kristala strukturo de Rba. Sphaeroides RC kunkristaligita kun citokromo c2 (PDB ID: 1L9B) ankaŭ ŝajnas havi fermitan QB-ejon. Tamen, en ĉi tiu kazo, la N-fina regiono de la RC-M polipeptido (interagante kun la QB-ligilo per la H-ligo de la Tyr-restaĵo sur la Q-helico) alprenas nenaturan formon, kaj la QB-konforma ŝanĝo ne estas plu esplorita (30). Kio estas trankviliga estas, ke ni ne vidis ĉi tiun specon de deformado de la M polipeptido en la RC-LH114-W strukturo, kiu estas preskaŭ la sama kiel la N-fina regiono de RC-LH116 RC. Ankaŭ notindas, ke post la ekstermado de la lesiv-bazita LH1-anteno, la apolipoproteinaj RC-oj en la PDB estis solvitaj, kio forigis la internajn kinonajn rezervujojn kaj lipidojn en la interspaco inter la RC kaj la interna surfaco de la ĉirkaŭa LH1-ringo (31, 32). RC restas funkcia ĉar ĝi retenas ĉiujn kofaktorojn, krom la malkomponeblan QB-kinonon, kiu estas malpli stabila kaj ofte perdiĝas dum la preparprocezo (33). Krome, oni scias, ke la forigo de LH1 kaj naturaj ciklaj lipidoj el RC povas havi efikon sur funkciojn, kiel ekzemple la mallongigitan vivdaŭron de la ŝargo-separita P+QB-stato (31, 34, 35). Tial, ni konjektas, ke la ekzisto de la loka LH1-ringo ĉirkaŭanta la RC povas konservi la "fermitan" QB-ejon, tiel konservante la lokan medion proksime al la QB.
Kvankam apolipoproteino (sen QB-kinono) kaj la kompleta strukturo reprezentas nur du momentfotojn de la ŝanĝiĝo de la QB-ejo, anstataŭ serion da eventoj, ekzistas indikoj, ke la ligado povas esti limigita por malhelpi religadon per hidrokinono por inhibicii substratan inhibicion. La interagado de kvinololo kaj kinono proksime al la QB-ejo de apolipoproteino povas esti malsama, kio kondukas al ĝia malakcepto fare de RC. Oni longe proponis, ke konformaj ŝanĝoj ludas rolon en la ligado kaj redukto de kinonoj. La kapablo de frostaj RC-oj redukti kinonojn post malluma adaptiĝo estas difektita (36); rentgen-kristalografio montras, ke ĉi tiu difekto ŝuldiĝas al tio, ke QB-kinonoj estas kaptitaj en "distala" konformacio ĉirkaŭ 4.5 Å de la aktiva proksimala pozicio (26), 37). Ni sugestas, ke ĉi tiu distala ligada konformacio estas momentfoto de la meza stato inter apolipoproteino kaj la plena ringa strukturo, kiu sekvas la komencan interagadon kun kinono kaj la malfermon de la QB-ejo.
La tipo II RC trovita en la PSII-komplekso de certaj fototrofaj bakterioj kaj cianobakterioj, algoj kaj plantoj havas strukturan kaj funkcian konservadon (38). La struktura vicigo montrita en Figuro 6 (D kaj E) emfazas la similecon inter PSII RC-oj kaj la QB-ejo de la bakteria RC-komplekso. Ĉi tiu komparo delonge estis modelo por studi la proksime rilatajn sistemojn de kinona ligado kaj redukto. Antaŭaj publikaĵoj sugestis, ke konformaj ŝanĝoj estas akompanataj de PSII-redukto de kinonoj (39, 40). Tial, konsiderante la evoluan konservadon de RC, ĉi tiu antaŭe neobservita ligmekanismo ankaŭ povus esti aplikebla al la QB-ejo de PSII RC en oksigenitaj fototrofaj plantoj.
Rps ΔpufW (neetikedita pufW-forigo) kaj PufW-His (C-fina 10x His-etikedita proteino-W esprimita el la natura pufW-lokuso) trostreĉoj. *palustris* CGA009 estis priskribita en nia antaŭa laboro (16). Ĉi tiuj trostreĉoj kaj la izogena sovaĝ-tipa gepatro estis reakiritaj el la frostujo per striigado de malgranda nombro da ĉeloj sur PYE (ĉiu 5 g litro -1) (konservita en LB je -80 °C, enhavanta 50% (p/v) glicerolo) proteinon, gistekstrakton kaj sukcinato) agaragaron [1.5% (p/v)]. La plato estis inkubata dumnokte en mallumo je ĉambra temperaturo sub malaerobaj kondiĉoj, kaj poste lumigita per blanka lumo (~50 μmolm-2 s-1) provizita de OSRAM 116-W halogenaj ampoloj (RS Components, UK) dum 3 ĝis 5 tagoj ĝis aperis unuopa kolonio. Unuopa kolonio estis uzata por inokuli 10 ml da M22+ medio (41) suplementita per 0.1% (p/v) kazaminacidoj (ĉi-poste nomata M22). La kulturo estis kreskigita sub malaltaj oksigenaj kondiĉoj en mallumo je 34°C kun skuado je 180 rpm dum 48 horoj, kaj poste 70 ml da la kulturo estis inokulitaj sub la samaj kondiĉoj dum 24 horoj. Duon-aeroba kulturo kun volumeno de 1 ml estas uzata por inokuli 30 ml da M22 medio en 30 ml universala ŝraŭbkovrila travidebla vitra botelo kaj surradiita kun skuado (~50μmolm-2 s-1) dum 48 horoj per sterila magneta forta kirlado. Poste 30 ml da la kulturo estis inokulitaj kun ĉirkaŭ 1 litro da kulturo sub la samaj kondiĉoj, kiu poste estis uzata por inokuli ĉirkaŭ 9 litrojn da kulturo lumigita je ~200 μmolm-2 s-1 dum 72 horoj. La ĉeloj estis rikoltitaj per centrifugado je 7132 RCF dum 30 minutoj, resuspenditaj en ~10 ml da 20 mM tris-HCl (pH 8.0), kaj konservitaj je -20 °C ĝis bezonate.
Post degelado, aldonu kelkajn kristalojn de deoksiribonukleazo I (Merck, UK), lizozimo (Merck, UK) kaj du tablojdojn de Roche-holoenzimaj proteazaj inhibitoroj (Merck, UK) al la resuspenditaj ĉeloj. En franca premĉelo kun 20.000 psio (Aminco, Usono), la ĉeloj estis disrompitaj 8 ĝis 12 fojojn. Post forigo de nerompitaj ĉeloj kaj nesolveblaj derompaĵoj per centrifugado je 18.500 RCF dum 15 minutoj je 4 °C, la membrano estis precipitigita el la pigmentigita lizato per centrifugado je 113.000 RCF dum 2 horoj je 43.000 °C. Forĵetu la solveblan frakcion kaj resuspendigu la koloritan membranon en 100 ĝis 200 ml da 20 mM tris-HCl (pH 8.0) kaj homogenigu ĝis ne plu estas videblaj agregaĵoj. La suspendita membrano estis inkubaciita en 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, Usono) enhavanta 2% (p/v) β-DDM dum 1 horo en mallumo je 4°C kun milda kirlado. Poste centrifugita je 70°C por dissolvi 150 000 RCF je 4°C dum 1 horo por forigi restajn nesolveblaĵojn.
La solubiliga membrano de la ΔpufW-bakteriaro estis aplikita al 50 ml DEAE Sepharose-jona interŝanĝa kolono kun tri kolumnaj volumoj (CV) de ligbufro [20 mM tris-HCl (pH 8.0) enhavanta 0.03% (p/v) β-DDM]. Lavu la kolonon per du CV-ligaj bufroj, kaj poste lavu la kolonon per du ligbufroj enhavantaj 50 mM NaCl. La RC-LH116-komplekso estis eluvita per lineara gradiento de 150 ĝis 300 mM NaCl (en ligbufro) je 1.75 CV, kaj la restanta ligkomplekso estis eluvita per ligbufro enhavanta 300 mM NaCl je 0.5 CV. Kolektu la sorban spektron inter 250 kaj 1000 nm, konservu la frakcion kun absorba proporcio (A880/A280) pli granda ol 1 je 880 ĝis 280 nm, diluu ĝin dufoje en la ligbufro, kaj uzu la saman proceduron denove sur la DEAE-kolumno. Post purigo, diluu la frakciojn kun A880/A280 proporcioj pli altaj ol 1.7 kaj A880/A805 proporcioj pli altaj ol 3.0, faru la trian rondon de jona interŝanĝo, kaj konservu frakciojn kun A880/A280 proporcioj pli altaj ol 2.2 kaj A880/A805 proporcioj pli altaj ol 5.0. La parte purigita komplekso estis koncentrita ĝis ~2 ml en centrifuga filtrilo Amicon 100,000 kun molekula pezo-limigo (MWCO) (Merck, UK), kaj ŝarĝita sur Superdex 200 16/600 grandecan ekskludan kolonon (GE Healthcare, Usono) enhavantan 200 mM NaCl-bufron, kaj poste eluvita en la sama bufro je 1.5 CV. Kolektu la sorbajn spektrojn de la grandeca ekskluda frakcio, kaj koncentru la sorbajn spektrojn kun A880/A280-proporcioj super 2.4 kaj A880/A805-proporcioj super 5.8 ĝis 100 A880, kaj tuj uzu ilin por krio-TEM-krado-preparado aŭ stokado. Konservu je -80°C ĝis bezonate.
La solubiliga membrano de la PufW-His-bakteriaro estis aplikita al 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose-kolumno (20 mM tris-HCl (pH 8.0) enhavanta 200 mM NaCl kaj 0.03% (p/p)) en IMAC-bufro (GE Healthcare). v) β-DDM]. La kolono estis lavita per kvin CV-oj de IMAC-bufro, kaj poste per kvin CV-oj de IMAC-bufro enhavanta 10 mM histidino. La kerna komplekso estis eluvita el la kolono per kvin IMAC-bufroj enhavantaj 100 mM histidino. La frakcio enhavanta la RC-LH114-W-komplekson estas koncentrita ĝis ~10 ml en kirlita tanko ekipita per Amicon 100,000 MWCO-filtrilo (Merck, UK), diluita 20 fojojn per liganta bufro, kaj poste aldonita al 25 ml. En la DEAE-Sepharose-kolumno, kvar CV-oj ligitaj al la bufro estas uzataj anticipe. Lavu la kolonon per kvar CV-ligaj bufroj, poste eluvu la komplekson sur ok CV-oj laŭ lineara gradiento de 0 ĝis 100 mM NaCl (en liga bufro), kaj la ceteraj kvar CV-oj enhavantaj 100 mM liga bufro. La restaj kompleksoj eluvitaj sur la natria klorido kombinita kun la A880/A280-proporcio pli alta ol 2.4 kaj la A880/A805-proporcio pli alta ol 4.6 frakcioj estis koncentritaj ĝis ~2 ml en Amicon 100,000 MWCO-centrifuga filtrilo, kaj plenigitaj per 1.5 CV IMAC antaŭe ekvilibrigita Superdex 200 16/600-grandeca ekskluda kolono, kaj poste eluvitaj en la sama bufro super 1.5 CV. Kolektu la sorbajn spektrojn de la grandec-ekskludaj frakcioj kaj koncentru la sorbajn spektrojn kun A880/A280-proporcioj super 2.1 kaj A880/A805-proporcioj super 4.6 ĝis 100 A880, kiuj estas tuj uzataj por preparo de frosta TEM-krado aŭ konservitaj je -80°C ĝis bezono.
Leica EM GP mergfrostujo estis uzata por prepari malalttemperaturajn TEM-kradojn. La komplekso estis diluita en IMAC-bufro ĝis A880 de 50, kaj poste 5 μl estis ŝarĝitaj sur nove bril-malŝarĝitan QUANTIFOIL 1.2/1.3 karbon-kovritan kupran reton (Agar Scientific, UK). Kovu la kradon je 20 °C kaj 60% relativa humideco dum 30 sekundoj, poste sekigu ĝin per absorbilo dum 3 sekundoj, kaj poste sensoifigu ĝin en likva etano je -176 °C.
La datumoj de la komplekso RC-LH114-W estis registritaj sur la eBIC (Elektronika Biobildiga Centro) (Brita Diamanta Lumfonto) per Titan Krios-mikroskopo, kiu funkcias je akcela tensio de 300kV, kun nominala pligrandigo de 130 000× kaj energio de - Elektu interspacon de 20 eV. Gatan 968 GIF Quantum kun K2-pinta detektilo estis uzata por registri bildojn en kalkulada reĝimo por kolekti datumojn. La kalibrita piksela grandeco estas 1,048 Å, kaj la dozofteco estas 3,83 e-Å⁻²s⁻¹. La filmo estis kolektita en 11 sekundoj kaj dividita en 40 partojn. Uzu la karbon-kovritan areon por refokusigi la mikroskopon, kaj poste kolekti tri filmojn por ĉiu truo. Entute, 3130 filmoj estis kolektitaj, kun malfokusaj valoroj inter -1 kaj -3 μm.
La datumoj por la komplekso RC-LH116 estis kolektitaj per la sama mikroskopo ĉe la Asterbury Biostructure Laboratory (Universitato de Leeds, Britio). La datumoj estis kolektitaj en kalkulada reĝimo kun pligrandigo de 130 k, kaj la piksela grandeco estis kalibrita al 1,065 Å kun dozo de 4,6 e-Å⁻²s⁻¹. La filmo estis filmita en 12 sekundoj kaj dividita en 48 partojn. Entute, 3359 filmoj estis kolektitaj, kun malfokusaj valoroj inter -1 kaj -3 μm.
Ĉiu datumprilaborado estas plenumata en la Relion 3.0 duktosistemo (42). Uzu Motioncorr 2 (43) por korekti la faskomoviĝon per dozopezo, kaj poste uzu CTFFIND 4.1 (44) por determini la parametron CTF (kontrasta transiga funkcio). Tipaj mikrofotoj post ĉi tiuj komencaj prilaboraj stadioj estas montritaj en Figuro 2. S16. La aŭtomata selektada ŝablono estas generita per mana selektado de ĉirkaŭ 250 pikseloj el 1000 partikloj en 250-piksela kadro kaj neniu referenca dudimensia (2D) klasifiko, tiel malakceptante tiujn klasifikojn, kiuj renkontas provaĵan poluadon aŭ ne havas distingeblajn karakterizaĵojn. Poste, aŭtomata selektado estis plenumata sur ĉiuj mikrofotoj, kaj la RC-LH114-W havis 849 359 partiklojn, kaj la RC-LH116-komplekso havis 476 547 partiklojn. Ĉiuj elektitaj partikloj spertis du raŭndojn de ne-referenca 2D klasifiko, kaj post ĉiu ciklo, la partikloj, kiuj renkontas la karbonan areon, provaĵan poluadon, neniujn evidentajn trajtojn aŭ forte interkovrantajn partiklojn, estas malakceptitaj, rezultante en 772 033 (90,9%) kaj 359 678 (75,5%) partikloj. La komenca 3D referenca modelo estis generita uzante la stokastan gradientan devenan metodon. Uzante la komencan modelon kiel referencon, la elektitaj partikloj estas klasifikitaj en kvar kategoriojn en 3D. Uzante la modelon en ĉi tiu kategorio kiel referencon, faru 3D-rafinadon sur la partikloj en la plej granda kategorio, poste uzu la komencan 15Å malalt-pasan filtrilon por kovri la solventan areon, aldonu 6 pikselojn da molaj randoj, kaj post-prilaboru la pikselojn por korekti la Gatan K2-pintan Moduladan transigan funkcion de la supra detektilo. Por la datumbazo RC-LH114-W, ĉi tiu komenca modelo estis modifita per forigo de la forta denseco ĉe la randoj de la masko (malkonektita de la kerna kompleksa denseco en UCSF Chimera). La rezultantaj modeloj (la rezolucioj de RC-LH114-W kaj RC-LH116 estas 3,91 kaj 4,16 Å, respektive) estas uzataj kiel referenco por la dua raŭndo de 3D-klasifiko. La uzitaj partikloj estas grupigitaj en la komencan 3D-klason kaj ne enhavas fortan korelacion kun la najbareco. Interkovro aŭ manko de evidentaj strukturaj trajtoj. Post la dua raŭndo de 3D-klasifiko, la kategorio kun la plej alta rezolucio estis elektita [Por RC-LH114-W, unu kategorio estas 377 703 partikloj (44,5%), por RC-LH116, estas du kategorioj, entute 260 752 partiklojn (54,7%), kie ili estas samaj nur kiam vicigitaj post la komenca rotacio kun malgranda diferenco]. La elektitaj partikloj estas re-ekstraktitaj en 400-piksela skatolo kaj rafinitaj per 3D-rafinado. La solventa masko estas generita uzante la komencan 15Å-an malalt-pasan filtrilon, 3-pikselan map-vastiĝon kaj 3-pikselan molan maskon. Uzante po-partiklan CTF-rafinadon, po-partiklan moviĝkorekton kaj la duan raŭndon de po-partikla CTF-rafinado, 3D-rafinado, solventa maskado kaj post-prilaborado estas faritaj post ĉiu paŝo por plue rafini la rezultan teksturon. Uzante la FSC (Fourier-Ŝela Korelacia Koeficiento) limvaloron de 0.143, la rezolucioj de la finaj modeloj de RC-LH114-W kaj RC-LH116 estas 2.65 kaj 2.80Å, respektive. La FSC-kurbo de la fina modelo estas montrita en Figuro 2. S17.
Ĉiuj proteinaj sekvencoj estas elŝutitaj de UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) estis uzata por konstrui homologian modelon de RC, kiu enhavas la proteinajn sekvencojn de RC-L, RC-M kaj RC-H kaj la kristalan strukturon de Rba. sphaeroides RC estis uzata kiel ŝablono (PDB ID: 5LSE) (46). Uzu la ilon "taŭga mapo" en UCSF Chimera por alĝustigi la generitan modelon al la mapo (47), plibonigi la proteinan strukturon, kaj aldoni kofaktoron [4×BChl a (monomera biblioteko restaĵonomo = BCL), 2×BPh a (BPH), unu aŭ du specoj de UQ10 (U10), unu ne-hema fero (Fe) kaj unu 3,4-dihidroheksakarbonilkolino (QAK)]. Uzu Coot (48) por aldoni. Ĉar QAK ne haveblas en la monomera biblioteko, ĝi estis parametrigita per la ilo eLBOW en PHENIX (49).
Poste, la LH1-subunuo estis konstruita. Komence, la aŭtomata konstruilo en PHENIX (49) estis uzata por aŭtomate konstrui parton de la LH1-sekvenco uzante la mapon kaj la LH1-α kaj LH1-β proteinajn sekvencojn kiel enigaĵon. Elektu la plej kompletan LH1-subunuon, eltiru ĝin kaj ŝarĝu ĝin en Coot, permane aldonu la mankantan sekvencon en ĝi, kaj permane rafinu la tutan strukturon antaŭ ol aldoni du BCl-ojn a (BCL) kaj spiriloksantinon (CRT) [laŭ la koncernaj Rps-oj. La denseco de la LH1-komplekso kaj la konata karotenoida enhavo. Specioj (17)]. Kopiu la kompletan LH1-subunuon, kaj uzu la UCSF Chimera "Docking Map Tool" por dokiĝi en la apuda ne-modela areo de LH1-denseco, kaj poste rafinu ĝin en Coot; ripetu la procezon ĝis ĉiuj LH1-subunuoj estas modelitaj. Por la strukturo RC-LH114-W, per eltiro de la neasignita denseco en la Coot, la proteino estas segmentita de la ceteraj ne-proteinaj komponantoj en la USCF Chimera mapo kaj la ilo Autobuild estas uzata por establi la komencan modelon, kaj la ceterajn subunuojn (proteino-W) Modelado. En PHENIX (49). Aldonu iujn ajn mankantajn sekvencojn al la rezulta modelo en Coot (48), kaj poste mane rafinu la tutan subunuon. La restanta neasignita denseco konvenas al la kombinaĵo de lipidoj (PDB monomera biblioteko ID de CDL = CDL, POPC = 6PL kaj POPG = PGT), β-DDM lesivo (LMT) kaj UQ10 molekuloj (U10). Uzu PHENIX-optimigon (49) kaj manan optimumigon en Coot (48) por perfektigi la kompletan komencan modelon ĝis la modelstatistikoj kaj la vida kvalito de la konveno ne plu plibonigeblas. Fine, uzu LocScale (50) por akrigi la lokan mapon, kaj poste plenumu plurajn aliajn ciklojn de modelado de la neasignita denseco kaj aŭtomatan kaj manan optimumigon.
La respektivaj peptidoj, kofaktoroj kaj aliaj lipidoj kaj kinonoj ligitaj ene de siaj respektivaj densecoj estas montritaj en Figuroj 1 kaj 2. S18 ĝis S23. La statistikaj informoj de la fina modelo estas montritaj en Tabelo S1.
Krom se alie specifite, la UV/Vis/NIR-sorbaj spektroj estis kolektitaj per Cary60-spektrofotometro (Agilent, Usono) je 1 nm-intervaloj de 250 nm ĝis 1000 nm kaj integriĝtempo de 0.1 sekundoj.
Diluu la specimenon en kvarca kuveto kun 2 mm vojo ĝis A880 de 1, kaj kolektigu la absorban spektron inter 400 kaj 1000 nm. La cirklaj dikroikaj spektroj estis kolektitaj per Jasco 810 spektropolarimetro (Jasco, Japanio) je 1 nm-aj intervaloj inter 400 nm kaj 950 nm kun skanrapideco de 20 nm min-1.
La molara ekstinga koeficiento estas determinita per diluado de la kerna komplekso ĝis A880 de proksimume 50. Diluu la 10μl volumenon en 990μl da ligbufro aŭ metanolo, kaj tuj kolektu la sorban spektron por minimumigi BChl-degeneron. La BChl-enhavo de ĉiu metanola specimeno estis kalkulita per la ekstinga koeficiento je 771 nm de 54.8 mM-1 cm-1, kaj la ekstinga koeficiento estis determinita (51). Dividu la mezuritan BChl-koncentriĝon per 32 (RC-LH114-W) aŭ 36 (RC-LH116) por determini la kerna komplekso-koncentriĝon, kiu poste estas uzata por determini la sorban spektron de la sama specimeno kolektita en la bufro. Ekstinga koeficiento. Tri ripetaj mezuradoj estis faritaj por ĉiu specimeno, kaj la meza absorbado de la BChl Qy-maksimumo estis uzata por kalkulo. La estingiĝa koeficiento de RC-LH114-W mezurita je 878 nm estas 3280±140 mM-1 cm-1, dum la estingiĝa koeficiento de RC-LH116 mezurita je 880 nm estas 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 estis kvantigita laŭ la metodo en (52). Mallonge, inversfaza HPLC (RP-HPLC) estis efektivigita uzante la Agilent 1200 HPLC-sistemon. Dissolvu ĉirkaŭ 0.02 nmol da RC-LH116 aŭ RC-LH114-W en 50μl da 50:50 metanolo:kloroformo enhavanta 0.02% (p/v) feran kloridon, kaj injektu la antaŭekvilibritan Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm Dissolvu en 1 ml⁻¹ min⁻¹ je 40°C en HPLC-solvilo (80:20 metanolo:2-propanolo) sur ×25 cm kolumnon. Faru izokratan eluadon en HPLC-solvilo por monitori absorbadon je 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoidoj) kaj 780 nm (BChl) dum 1 horo. La pinto en la 275 nm kromatogramo je 25.5 minutoj estis integrita, kiu ne enhavis iujn ajn aliajn detekteblajn kombinaĵojn. La integrita areo estas uzata por kalkuli la molan kvanton de ekstraktita UQ10 rilate al la kalibra kurbo kalkulita per la injekto de puraj normoj de 0 ĝis 5.8 nmol (Figuro S14). Ĉiu specimeno estis analizita en tri ripetoj, kaj la raportita eraro respondas al la norma devio de la averaĝo.
Solvaĵo enhavanta la RC-LH1-komplekson kun maksimuma Qy-absorbo de 0.1 estis preparita kun 30 μM reduktita ĉevalkora citokromo c2 (Merck, UK) kaj 0 ĝis 50 μMUQ2 (Merck, UK). Tri 1-ml specimenoj estis preparitaj ĉe ĉiu UQ2-koncentriĝo kaj inkubaciitaj dumnokte en mallumo je 4°C por certigi kompletan adaptiĝon al la mallumo antaŭ mezurado. La solvaĵo estis ŝarĝita en OLIS RSM1000 modulan spektrofotometron ekipitan per 300 nm flamo/500-linia krado, 1.24 mm eniro, 0.12 mm mezo kaj 0.6 mm eliraj fendoj. 600 nm longa pasa filtrilo estas metita ĉe la enirejo de la prova fototubo kaj la referenca fotomultiplika tubo por ekskludi ekscitan lumon. La absorbo estis monitorita je 550 nm kun integriĝtempo de 0.15 s. La ekscita lumo estas elsendata de la 880 nm M880F2 LED (Lum-Eliganta Diodo) (Thorlabs Ltd., UK) tra fibro-optika kablo je 90% intenseco tra DC2200-regilo (Thorlabs Ltd., UK) kaj estas elsendata al la lumfonto laŭ angulo de 90°. La mezurfasko estas kontraŭa al la spegulo por redoni ajnan lumon, kiu ne estis komence absorbita de la specimeno. Monitoru la absorbon 10 sekundojn antaŭ la lumintenseco de 50 sekundoj. Poste la absorbo estis plue monitorata dum 60 sekundoj en mallumo por taksi la amplekson, je kiu kvinololo spontanee reduktas citokromon c23+ (vidu Figuron S8 por krudaj datumoj).
La datumoj estis prilaboritaj per alĝustigo de lineara komenca rapido ene de 0,5 ĝis 10 sekundoj (depende de la UQ2-koncentriĝo) kaj averaĝante la rapidojn de ĉiuj tri specimenoj ĉe ĉiu UQ2-koncentriĝo. La RC-LH1-koncentriĝo kalkulita per la respektiva formorta koeficiento estis uzata por konverti la rapidon en la katalizan efikecon, grafike prezentitan en Origin Pro 2019 (OriginLab, Usono), kaj alĝustigita al la Michaelis-Menten-modelo por determini la ŝajnajn Km kaj Kcat-valorojn.
Por pasemaj sorbaj mezuradoj, la RC-LH1-specimeno estis diluita ĝis ~2μM en IMAC-bufro enhavanta 50 mM natrian askorbaton (Merck, Usono) kaj 0.4 mM Terbutin (Merck, Usono). Askorbata acido estas uzata kiel oferelektrondonanto, kaj tert-butaklofeno estas uzata kiel QB-inhibiciilo por certigi, ke la ĉefa RC-donanto restas reduktita (tio estas, ne fotooksidigita) dum la tuta mezurprocezo. Ĉirkaŭ 3 ml da specimeno estas aldonitaj al kutima rotacianta ĉelo (ĉirkaŭ 0.1 m en diametro, 350 RPM) kun 2 mm optika vojlongo por certigi, ke la specimeno en la lasera vojo havas sufiĉe da tempo por malluma adaptiĝo inter ekscitaj pulsoj. Uzu ~100-fs laserajn pulsojn por amplifiki la Ti:Safiran lasersistemon (Spectra Physics, Usono) por eksciti la specimenon je 880 nm kun ripetfrekvenco de 1 kHz (20 nJ por NIR aŭ 100 nJ por Vis). Antaŭ ol kolekti datumojn, eksponu la specimenon al ekscita lumo dum ĉirkaŭ 30 minutoj. Eksponiĝo kaŭzos QA-malaktivigon (eble reduktante QA-on unu aŭ du fojojn). Sed bonvolu noti, ke ĉi tiu procezo estas reigebla, ĉar post longa periodo de malluma adaptiĝo, RC malrapide revenos al QA-aktiveco. Helios-spektrometro (Ultrafast Systems, Usono) estis uzata por mezuri pasemajn spektrojn kun prokrasto de -10 ĝis 7000 ps. Uzu la programaron Surface Xplorer (Ultrafast Systems, Usono) por malgrupigi la datumarojn, poste kunfandi kaj normigi. Uzu la programaron CarpetView (Light Conversion Ltd., Litovio) por uzi la kombinitan datumaron por akiri diferencigajn spektrojn rilatajn al kadukiĝo, aŭ uzu funkcion, kiu konvolvas plurajn eksponentojn kun la instrumento-respondo por konveni al la unu-ondolonga spektra evoluo en Origin (OriginLab, Usono).
Kiel menciite supre (53), fotosinteza filmo enhavanta LH1-komplekson sen kaj RC kaj periferia LH2-anteno estis preparita. La membrano estis diluita en 20 mM tris (pH 8.0) kaj poste ŝarĝita en kvarcan kuveton kun 2 mm optika vojo. 30nJ lasera pulso estis uzata por eksciti la specimenon je 540 nm kun prokrasto de -10 ĝis 7000 ps. Prilaboru la datumaron kiel priskribite por Rps.pal specimeno.
La membrano estis peletigita per centrifugado je 150,000 RCF dum 2 horoj je 4°C, kaj poste ĝia absorbado je 880 nm estis resuspendita en 20 mM tris-HCl (pH 8.0) kaj 200 mM NaCl. Dissolvu la membranon per malrapida kirlado en 2% (p/v) β-DDM dum 1 horo en mallumo je 4°C. La specimeno estis diluita en 100 mM trietilamonia karbonato (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) ĝis proteina koncentriĝo de 2.5 mg ml-1 (Bio-Rad analizo). Plia prilaborado estis efektivigita laŭ la antaŭe publikigita metodo (54), komencante per la diluo de 50 μg da proteino en totalon de 50 μl da TEAB enhavanta 1% (p/v) natrian laŭraton (Merck, UK). Post sonikado dum 60 sekundoj, ĝi estis reduktita per 5 mM tris(2-karboksietil)fosfino (Merck, UK) je 37°C dum 30 minutoj. Por S-alkiligo, kovu la specimenon kun 10 mM metil-S-metiltiometansulfonato (Merck, UK) kaj aldonu ĝin el 200 mM izopropanola stoksolvaĵo dum 10 minutoj je ĉambra temperaturo. Proteolitika digestado estis efektivigita per aldono de 2 μg da tripsino/endoproteinaza Lys-C miksaĵo (Promega UK) kaj inkubuita je 37°C dum 3 horoj. La laŭrata surfaktanto estis ekstraktita per aldono de 50 μl da etila acetato kaj 10 μl da 10% (v/v) LC-grada trifluoroacetata acido (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) kaj kirlado dum 60 sekundoj. La fazapartigo estis antaŭenigita per centrifugado je 15,700 RCF dum 5 minutoj. Laŭ la protokolo de la fabrikanto, C18-spinkolono (Thermo Fisher Scientific, UK) estis uzata por zorge aspiri kaj sensali la pli malaltan fazon enhavantan la peptidon. Post sekigado per vakua centrifugado, la specimeno estis solvita en 0.5% TFA kaj 3% acetonitrilo, kaj 500 ng estis analizitaj per nanoflua RP-kromatografio kunligita kun masspektrometrio uzante la sistemajn parametrojn detaligitajn antaŭe.
Uzu MaxQuant v.1.5.3.30 (56) por proteina identigo kaj kvantigo por serĉi la proteoman datumbazon de Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). La proteomikaj datumoj pri mas-spektrometrio estis deponitaj en la ProteomeXchange Alliance per la PRIDE-partnera deponejo (http://proteomecentral.proteomexchange.org) sub la datumar-identigilo PXD020402.
Por analizo per RPLC kunligita kun elektrospraja joniga masspektrometrio, la RC-LH1-komplekso estis preparita el sovaĝ-tipaj Rp-oj. Uzante la antaŭe publikigitan metodon (16), la proteina koncentriĝo produktita en palustris-ĉeloj estis 2 mg ml-1 en 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl kaj 0.03% (p/v) β- (Bio-Rad-analizo)) DDM. Laŭ la protokolo de la fabrikanto, uzu 2D-purigan ilaron (GE Healthcare, Usono) por ekstrakti 10 μg da proteino per precipitaĵa metodo, kaj solvu la precipitaĵon en 20 μl da 60% (v/v) formika acido (FA), 20% (v/v) Acetonitrilo kaj 20% (v/v) akvo. Kvin mikrolitroj estis analizitaj per RPLC (Dionex RSLC) kunligita kun masspektrometrio (Maxis UHR-TOF, Bruker). Uzu MabPac 1.2×100 mm kolumnon (Thermo Fisher Scientific, UK) por apartigo je 60°C kaj 100μlmin-1, kun gradiento de 85% (v/v) solvilo A [0.1% (v/v) FA kaj 0.02% (V/v) TFA akva solvaĵo] ĝis 85%(v/v) solvilo B [0.1%(v/v) FA kaj 0.02%(v/v) en 90%(v/v) acetonitrila TFA]. Uzante norman elektrosprajan jonigan fonton kaj defaŭltajn parametrojn dum pli ol 60 minutoj, la masspektrometro akiras 100 ĝis 2750 m/z (maso-ŝarga rilatumo). Kun la helpo de la ilo FindPept de la bioinformadika rimeda portalo ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), mapu la masspektron al la subunuoj de la komplekso.
La ĉeloj estis kreskigitaj dum 72 horoj sub 100 ml da NF-malalta (10μMm-2 s-1), meza (30μMm-2 s-1) aŭ alta (300μMm-2 s-1) lumo. M22-medio (M22-medio en kiu amonia sulfato estas preterlasita kaj natria sukcinato estas anstataŭigita per natria acetato) en 100 ml ŝraŭbŝtopila botelo (23). En kvin 30-sekundaj cikloj, 0,1 mikrometraj vitroperloj estis perligitaj je volumena proporcio de 1:1 por lizi la ĉelojn kaj malvarmigitaj sur glacio dum 5 minutoj. La nesolvebla materio, nerompitaj ĉeloj kaj vitroperloj estis forigitaj per centrifugado je 16,000 RCF dum 10 minutoj en labortabla mikrocentrifugilo. La membrano estis apartigita en Ti 70.1 rotoro kun 100,000 RCF en 20 mM tris-HCl (pH 8.0) kun 40/15% (p/p) sakaroza gradiento dum 10 horoj.
Kiel priskribite en nia antaŭa laboro, imunodetekto de la His-etikedo sur PufW (16). Mallonge, la purigita kerna komplekso (11.8 nM) aŭ la membrano enhavanta la saman koncentriĝon de RC (determinita per oksidado subtrahante la reduktitan diferencan spektron kaj kongruigante la ŝarĝon sur la makulita ĝelo) en 2x SDS-ŝarĝa bufro (Merck, UK) diluita dufoje. La proteinoj estis apartigitaj sur kopia 12% bis-tris NuPage-ĝelo (Thermo Fisher Scientific, UK). Ĝelo estis makulita per Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) por ŝarĝi kaj bildigi la RC-L-subunuon. La proteino sur la dua ĝelo estis transdonita al metanol-aktivigita polivinilidenfluorida (PVDF) membrano (Thermo Fisher Scientific, UK) por imunoanalizo. La PVDF-membrano estis blokita en 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 kaj 5% (p/v) senkremigita laktopulvoro, kaj poste inkubita kun la kontraŭ-His primara antikorpo (en diluita antikorpa bufro [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl kaj 0.05% (v/v) Tween-20] en 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, Usono) dum 4 horoj. Post lavado 3-foje dum 5 minutoj en antikorpa bufro, la membrano estis kombinita kun krenoperoksidazo (Sigma-Aldrich, UK) kontraŭ-musa sekundara antikorpo (diluita 1:10,000 en antikorpa bufro). Inkubu por ebligi detekton (5 minutojn post 3 lavoj en antikorpa bufro) uzante WESTAR ETA C 2.0 kemilumineskan substraton (Cyanagen, Italio) kaj Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Desegnante la intensecan distribuon de ĉiu makulita ĝelo aŭ imunanaliza leno, integrado de la areo sub la pinto kaj kalkulante la intensecan rilatumon de RC-L (makulita ĝelo) kaj Proteino-W (imunanalizo), en ImageJ (57) prilaboru la bildon. Ĉi tiuj rilatumoj estis konvertitaj al molaraj rilatumoj supozante, ke la rilatumo de RC-L al proteino-W en la pura RC-LH114-W specimeno estis 1:1 kaj normaligante la tutan datumaron laŭe.
Por suplementaj materialoj por ĉi tiu artikolo, bonvolu vidi http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Ĉi tiu estas artikolo kun libera aliro, distribuita laŭ la kondiĉoj de la Krea Komunaĵo Atribua Permesilo. La artikolo permesas senrestriktan uzon, distribuon kaj reproduktadon en iu ajn medio, kondiĉe ke la originala verko estu konvene citita.
Noto: Ni nur petas vin provizi vian retpoŝtadreson por ke la persono, kiun vi rekomendas al la paĝo, sciu, ke vi volas, ke ili vidu la retpoŝton kaj ke ĝi ne estas spamo. Ni ne kaptos iujn ajn retpoŝtadresojn.
Ĉi tiu demando estas uzata por testi ĉu vi estas vizitanto kaj malhelpi aŭtomatan spam-sendon.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
La alt-rezolucia strukturo de la lumkaptilo 1 komplekso en la reakcia centro provizas novajn komprenojn pri la kinona dinamiko.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
La alt-rezolucia strukturo de la lumkaptilo 1 komplekso en la reakcia centro provizas novajn komprenojn pri la kinona dinamiko.
©2021 Amerika Asocio por la Akcelo de Scienco. ĉiuj rajtoj rezervitaj. AAAS estas partnero de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef kaj COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.