Nuna *Nuna adreso: Kolonjo 50931, Germanio, Kolonja Ekscelenco-Grupo Esploro pri Ĉela Stresa Respondo al Maljuniĝo-rilataj Malsanoj (CECAD).
La neŭrodegenerado de mitokondriaj malsanoj estas konsiderata nemaligebla ĉar la metabola plastikeco de neŭronoj estas limigita, sed la efiko de mitokondria misfunkcio sur la ĉelan aŭtonomecon de neŭrona metabolo en la korpo estas malbone komprenata. Ĉi tie, ni prezentas la ĉelspecifan proteomon de Purkinje-neŭronoj kun progresema OXPHOS-manko kaŭzita de interrompita mitokondria fuzia dinamiko. Ni trovis, ke mitokondria misfunkcio ekigis profundan ŝanĝon en la kampo de proteomiko, kiu finfine kondukis al la sinsekva aktivigo de precizaj metabolaj programoj antaŭ ĉelmorto. Neatendite, ni determinis la evidentan indukton de piruvata karboksilazo (PCx) kaj aliaj kontraŭ-aĝiĝaj enzimoj, kiuj kompletigas la intermediatojn de la TCA-ciklo. Inhibicio de PCx plimalbonigis oksidativan streson kaj neŭrodegeneradon, indikante, ke aterosklerozo havas protektan efikon en neŭronoj malhavantaj OXPHOS. La restarigo de mitokondria fuzio en fine degeneritaj neŭronoj tute inversigas ĉi tiujn metabolajn karakterizaĵojn, tiel malhelpante ĉelmorton. Niaj trovoj identigas antaŭe nekonatajn vojojn, kiuj donas rezistecon al mitokondria misfunkcio kaj montras, ke neŭrodegenerado povas esti inversigita eĉ en la malfruaj stadioj de la malsano.
La centra rolo de mitokondrioj en la bontenado de neŭrona energimetabolo estas emfazita per la ampleksaj neŭrologiaj simptomoj asociitaj kun homaj mitokondriaj malsanoj. La plej multaj el ĉi tiuj malsanoj estas kaŭzitaj de genaj mutacioj, kiuj reguligas mitokondrian genan esprimon (1, 2) aŭ genan detruon rilatan al mitokondria dinamiko, kiu nerekte influas la stabilecon de mitokondria DNA (mtDNA) (3, 4). Laboro en bestaj modeloj montris, ke responde al mitokondria misfunkcio en ĉirkaŭaj histoj, konservativaj metabolaj vojoj (5-7) povas esti aktivigitaj, kio provizas gravajn informojn por profunda kompreno de la patogenezo de ĉi tiuj kompleksaj malsanoj. En akra kontrasto, nia kompreno pri la metabolaj ŝanĝoj de specifaj ĉeltipoj kaŭzitaj de la ĝenerala malsukceso de cerba mitokondria adenozina trifosfato (ATP) produktado estas fundamenta (8), emfazante la bezonon identigi terapiajn celojn, kiuj povas esti uzataj por preventi aŭ malhelpi malsanojn. Malhelpi neŭrodegeneradon (9). La manko de informoj estas la fakto, ke nervĉeloj estas ĝenerale konsiderataj havi tre limigitan metabolan flekseblecon kompare kun la ĉeltipoj de ĉirkaŭaj histoj (10). Ĉar ĉi tiuj ĉeloj ludas centran rolon en kunordigado de la liverado de metabolitoj al neŭronoj por antaŭenigi sinaptan transdonon kaj respondi al vundoj kaj malsanoj, la kapablo adapti ĉelan metabolon al la malfacilaj kondiĉoj de cerba histo estas preskaŭ limigita al gliaj ĉeloj (11-14). Krome, la eneca ĉela diverseco de cerba histo plejparte malhelpas la studon de metabolaj ŝanĝoj, kiuj okazas en specifaj neŭronaj subgrupoj. Rezulte, malmulte oni scias pri la precizaj ĉelaj kaj metabolaj sekvoj de mitokondria misfunkcio en neŭronoj.
Por kompreni la metabolajn sekvojn de mitokondria misfunkcio, ni izolis Purkinje-neŭronojn (PN) en malsamaj stadioj de neŭrodegenerado kaŭzita de la detruo de la mitokondria ekstermembrana fuzio (Mfn2). Kvankam Mfn2-mutacioj en homoj estas asociitaj kun formo de hereda motora sensa neuropatio konata kiel Charcot-Marie-Tooth tipo 2A (15), la kondiĉa detruo de Mfn2 en musoj estas bone agnoskita metodo de indukto de oksidiga fosforiligo (OXPHOS). La diversaj neŭronaj subtipoj (16-19) kaj la rezulta neŭrodegenera fenotipo estas akompanataj de progresemaj neŭrologiaj simptomoj, kiel ekzemple movaj perturboj (18, 19) aŭ cerebela ataksio (16). Uzante kombinaĵon de senmarkaj kvantumaj (LFQ) proteomiko, metabolomiko, bildigo kaj virusologiaj metodoj, ni montras, ke progresema neŭrodegenerado forte induktas piruvatan karboksilazon (PCx) kaj aliajn faktorojn implikitajn en arteriosklerozo de PN en vivo. La esprimo de enzimoj. Por kontroli la gravecon de ĉi tiu trovo, ni specife malsuprenreguligis la esprimon de PCx en Mfn2-mankhavaj PN-oj, kaj trovis, ke ĉi tiu operacio plimalbonigis oksidativan streson kaj akcelis neŭrodegeneradon, tiel pruvante, ke azoospermio donas ĉelmorton. Metabola adaptiĝemo. Severa esprimo de MFN2 povas tute savi la finan degeneradon de PN kun severa OXPHOS-manko, amasa konsumo de mitokondria DNA, kaj ŝajne rompita mitokondria reto, kio plue emfazas, ke ĉi tiu formo de neŭrodegenerado eĉ povas resaniĝi en la progresinta stadio de la malsano antaŭ ĉelmorto.
Por bildigi la mitokondriojn en Mfn2-knokaŭtaj PN-oj, ni uzis musan trostreĉon, kiu permesas al Cre-dependaj mitokondrioj celi la esprimon de la flava fluoreska proteino (YFP) (mtYFP) (20) kaj kontrolis la mitokondrian morfologion in vivo. Ni trovis, ke la detruo de la Mfn2-geno en PN-oj kondukus al laŭgrada disiĝo de la mitokondria reto (Figuro S1A), kaj la plej frua ŝanĝo estis trovita je 3 semajnoj de aĝo. Kontraste, la konsiderinda degenero de la PN-ĉeltavolo, kiel evidentiĝas per la perdo de Kalbindina imunokoloriĝo, ne komenciĝis ĝis 12 semajnoj de aĝo (Figuro 1, A kaj B). La tempa miskongruo inter la plej fruaj ŝanĝoj en mitokondria morfologio kaj la videbla komenco de neŭrona morto instigis nin esplori la metabolajn ŝanĝojn ekigitajn de mitokondria misfunkcio antaŭ ĉelmorto. Ni evoluigis strategion bazitan sur fluoresk-aktivigita ĉelsortigo (FACS) por izoli YFP (YFP+)-esprimantajn PN (Figuro 1C), kaj en kontrolmusoj (Mfn2+ / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), ĉi-poste nomataj CTRL (Figuro S1B). La optimumigo de la pordega strategio bazita sur la relativa intenseco de la YFP-signalo permesas al ni purigi la YFP+-korpon (YFPhigh) de PN-oj de ne-PN-oj (YFPneg) (Figuro S1B) aŭ supozeblaj fluoreskaj aksonoj/dendritaj fragmentoj (YFPlow; Figuro S1D, maldekstre), konfirmite per konfokusa mikroskopo (Figuro S1D, dekstre). Por kontroli la identecon de la klasifikita populacio, ni faris LFQ-proteomikon kaj poste ĉefkomponantan analizon, kaj trovis, ke ekzistas klara apartigo inter YFPhigh kaj YFPneg ĉeloj (Figuro S1C). YFPhigh-ĉeloj montris netan riĉiĝon de konataj PN-indikiloj (ekz. Calb1, Pcp2, Grid2 kaj Itpr3) (21, 22), sed neniun riĉiĝon de proteinoj ofte esprimitaj en neŭronoj aŭ aliaj ĉeltipoj (Figuro 1D). Komparo inter specimenoj en klasifikitaj YFPhigh-ĉeloj kolektitaj en sendependaj eksperimentoj montris korelacian koeficienton > 0.9, montrante bonan reprodukteblecon inter biologiaj ripetoj (Figuro S1E). Resumante, ĉi tiuj datumoj validigis nian planon por akuta kaj specifa izolado de farebla PN. Ĉar la uzita pelila sistemo L7-cre induktas mosean rekombinadon en la unua semajno post nasko (23), ni komencis buĉi musojn el CTRL kaj kondiĉa (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Kolektas neŭronojn. Post kiam la rekombinado estas kompleta, ĝi nomiĝas Mfn2cKO je 4 semajnoj de aĝo. Kiel la finpunkton, ni elektis 8 semajnojn de aĝo kiam la PN-tavolo estis sendifekta malgraŭ la evidenta mitokondria fragmentiĝo (Figuro 1B kaj Figuro S1A). Entute, ni kvantigis entute 3013 proteinojn, el kiuj ĉirkaŭ 22% baziĝis sur MitoCarta 2.0-anotadoj bazitaj sur la mitokondria proteomo kiel mitokondrioj (Figuro 1E) (Figuro 1E) (24). La analizo de diferenciga genekspresio farita en semajno 8 montris, ke nur 10.5% de ĉiuj proteinoj havis signifajn ŝanĝojn (Figuro 1F kaj Figuro S1F), el kiuj 195 proteinoj estis malsuprenreguligitaj kaj 120 proteinoj estis suprenreguligitaj (Figuro 1F). Indas rimarki, ke la "noviga vojanalizo" de ĉi tiu datumbazo montras, ke la diference esprimitaj genoj ĉefe apartenas al limigita aro de specifaj metabolaj vojoj (Figuro 1G). Interese, kvankam la malsuprenreguligo de vojoj rilataj al OXPHOS kaj kalcia signalado konfirmas la indukton de mitokondria misfunkcio en fuzio-mankhavaj PN-oj, aliaj kategorioj, kiuj ĉefe implikas aminoacidan metabolon, estas signife suprenreguligitaj, kio konformas al la metabolo, kiu okazas en mitokondriaj PN-oj. Rekabligo estas kohera.
(A) Reprezentaj konfokusaj fotoj de cerebelaj sekcioj de CTRL kaj Mfn2cKO-musoj montrantaj progreseman perdon de PN-oj (kalbindino, griza); nukleoj estis kontraŭkolorigitaj per DAPI. (B) Kvantigo de (A) (unudirekta analizo de varianco, ***P<0.001; n = 4 ĝis 6 cirkloj de tri musoj). (C) Eksperimenta laborfluo. (D) Varmomapa distribuo de markiloj specifaj por Purkinje (supre) kaj aliaj ĉeltipoj (meze). (E) Venn-diagramo montranta la nombron de mitokondriaj proteinoj identigitaj en la klasifikita PN. (F) Vulkano-diagramo de diference esprimitaj proteinoj en Mfn2cKO-neŭronoj je 8 semajnoj (signifo-limvaloro de 1.3). (G) La analizo de la kreiva vojo montras la kvin plej gravajn suprenreguligajn (ruĝajn) kaj malsuprenreguligajn (bluajn) vojojn en la Mfn2cKO PN klasifikita kiel 8 semajnoj. La meza esprimnivelo de ĉiu detektita proteino estas montrita. Griza varmomapo: adaptita P-valoro. ns, ne grava.
Proteomikaj datumoj montris, ke la proteina esprimo de kompleksoj I, III, kaj IV iom post iom malpliiĝis. Kompleksoj I, III, kaj IV ĉiuj enhavis esencajn mtDNA-ĉifritajn subunuojn, dum komplekso II, kiu estis nur nukle-kodita, estis baze netuŝita (Figuro 2A kaj Figuro S2A). . Kongrue kun la proteomikaj rezultoj, imunohistokemio de cerebelaj histaj sekcioj montris, ke la nivelo de MTCO1 (mitokondria citokromo C oksidaza subunuo 1) subunuo de komplekso IV en PN iom post iom malpliiĝis (Figuro 2B). La mtDNA-ĉifrita subunuo Mtatp8 estis signife reduktita (Figuro S2A), dum la stabila nivelo de la nukle-ĉifrita ATP-sinteza subunuo restis senŝanĝa, kio kongruas kun la konata stabila ATP-sinteza subasembleo F1-komplekso kiam mtDNA-esprimo estas stabila. La formado estas kongrua. Interrompo (7). Taksado de la mtDNA-nivelo en la ordigitaj Mfn2cKO PN-oj per realtempa polimeraza ĉenreakcio (qPCR) konfirmis la laŭgradan malpliiĝon de la mtDNA-kopionombro. Kompare kun la kontrolgrupo, je 8 semajnoj de aĝo, nur ĉirkaŭ 20% de la mtDNA-nivelo estis retenita (Figuro 2C). Konforme al ĉi tiuj rezultoj, la konfokusa mikroskopa kolorigo de Mfn2cKO PN-oj estis uzata por detekti DNA-on, montrante la tempodependan konsumon de mitokondriaj nukleotidoj (Figuro 2D). Ni trovis, ke nur kelkaj kandidatoj implikitaj en mitokondria proteina degenerado kaj stresa respondo estis suprenreguligitaj, inkluzive de Lonp1, Afg3l2 kaj Clpx, kaj OXPHOS-kompleksaj kunigfaktoroj. Neniuj signifaj ŝanĝoj en la niveloj de proteinoj implikitaj en apoptozo estis detektitaj (Figuro S2B). Simile, ni trovis, ke la mitokondrioj kaj endoplasma retikula kanaloj implikitaj en kalcia transporto havas nur malgrandajn ŝanĝojn (Figuro S2C). Krome, la taksado de aŭtofagi-rilataj proteinoj ne trovis signifajn ŝanĝojn, kio kongruas kun la videbla indukto de aŭtofagosomoj observita in vivo per imunohistokemio kaj elektronmikroskopio (Figuro S3). Tamen, la progresema OXPHOS-misfunkcio en PN-oj estas akompanata de evidentaj ultrastrukturaj mitokondriaj ŝanĝoj. Mitokondriaj aretoj videblas en la ĉelkorpoj kaj dendritaj arboj de Mfn2cKO PN-oj aĝantaj 5 kaj 8 semajnojn, kaj la interna membranstrukturo spertis profundajn ŝanĝojn (Figuro S4, A kaj B). Kongrue kun ĉi tiuj ultrastrukturaj ŝanĝoj kaj signifa malpliiĝo de mtDNA, analizo de akutaj cerbaj cerebelaj tranĉaĵoj kun tetrametilrodamina metilestero (TMRM) montris, ke la mitokondria membranpotencialo en Mfn2cKO PN-oj estis signife malpliigita (Figuro S4C).
(A) Analizo laŭ tempo de la esprimonivelo de OXPHOS-komplekso. Konsideru nur proteinojn kun P<0.05 je 8 semajnoj (dudirekta ANOVA). Punktita linio: Neniu alĝustigo kompare kun CTRL. (B) Maldekstre: Ekzemplo de cerebela sekcio markita per kontraŭ-MTCO1-antikorpo (skalbreto, 20 μm). La areo okupita de Purkinje-ĉelkorpoj estas kovrita per flava. Dekstre: Kvantigo de MTCO1-niveloj (unudirekta variancanalizo; n = 7 ĝis 20 ĉeloj analizitaj de tri musoj). (C) qPCR-analizo de mtDNA-kopionombro en la ordigita PN (unudirekta variancanalizo; n = 3 ĝis 7 musoj). (D) Maldekstre: Ekzemplo de cerebela tranĉaĵo markita per kontraŭ-DNA-antikorpo (skalbreto, 20 μm). La areo okupita de Purkinje-ĉelkorpoj estas kovrita per flava. Dekstre: Kvantigo de mtDNA-lezoj (unudirekta variancanalizo; n = 5 ĝis 9 ĉeloj de tri musoj). (E) Ekzemplo de akuta cerebela sekco montranta mitoYFP + Purkinje-ĉelojn (sago) en tutĉela pecklampa registrado. (F) Kvantigo de IV-kurbo. (G) Reprezentaj registradoj de malpolariga kurenta injekto en CTRL kaj Mfn2cKO Purkinje-ĉeloj. Supra spuro: La unua pulso kiu ekigis AP. Malsupra spuro: Maksimuma AP-frekvenco. (H) Kvantigo de postsinapsaj spontaneaj enigoj (sPSP-oj). La reprezenta registra spuro kaj ĝia zomproporcio estas montritaj en (I). Unudirekta variancoanalizo analizis n = 5 ĝis 20 ĉelojn de tri musoj. Datumoj estas esprimitaj kiel meznombro±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Reprezentaj spuroj de spontanea AP registrita uzante la truitan pecklampan reĝimon. Supra spuro: Maksimuma AP-frekvenco. Malsupra spuro: zomo de ununura AP. (K) Kvantigu la mezan kaj maksimuman AP-frekvencon laŭ (J). Mann-Whitney-testo; n = 5 ĉeloj estis analizitaj de kvar musoj. Datumoj estas esprimitaj kiel meznombro±SEM; ne gravaj.
Evidenta OXPHOS-difekto estis detektita en la 8-semajna Mfn2cKO PN, indikante ke la fiziologia funkcio de neŭronoj estas grave nenormala. Tial, ni analizis la pasivajn elektrajn karakterizaĵojn de OXPHOS-mankhavaj neŭronoj je 4 ĝis 5 semajnoj kaj 7 ĝis 8 semajnoj per registradoj de tutĉelaj pecetaj krampoj en akutaj cerebelaj tranĉaĵoj (Figuro 2E). Neatendite, la meza ripoza membrana potencialo kaj enira rezisto de Mfn2cKO-neŭronoj estis similaj al la kontrolo, kvankam ekzistis subtilaj diferencoj inter la ĉeloj (Tabelo 1). Simile, je 4 ĝis 5 semajnoj de aĝo, neniuj signifaj ŝanĝoj en la kurento-tensia rilato (IV-kurbo) estis trovitaj (Figuro 2F). Tamen, neniuj Mfn2cKO-neŭronoj 7 ĝis 8 semajnojn aĝaj postvivis la IV-reĝimon (hiperpolariga paŝo), indikante ke ekzistas klara sentemo al hiperpolariga potencialo en ĉi tiu malfrua stadio. Kontraste, en Mfn2cKO-neŭronoj, la malpolarigaj kurentoj, kiuj kaŭzas ripetajn agpotencialojn (PA) malŝarĝojn, estas bone tolerataj, indikante, ke iliaj ĝeneralaj malŝarĝaj ŝablonoj ne signife diferencas de tiuj de 8-semajnaj kontrolneŭronoj (Tabelo 1 kaj Figuro 2G). Simile, la frekvenco kaj amplitudo de spontaneaj postsinapsaj kurentoj (sPSC-oj) estis kompareblaj al tiuj de la kontrolgrupo, kaj la frekvenco de eventoj pliiĝis de 4 semajnoj ĝis 5 semajnoj ĝis 7 semajnoj ĝis 8 semajnoj kun simila pliiĝo (Figuro 2, H kaj I). La periodo de sinapta maturiĝo en PN-oj (25). Similaj rezultoj estis akiritaj post truitaj PN-pecetoj. Ĉi tiu konfiguracio malhelpas la eblan kompenson de ĉelaj ATP-difektoj, kiel povus okazi en registrado de tutĉelaj pecetaj krampoj. Aparte, la ripozmembrana potencialo kaj spontanea pafofrekvenco de Mfn2cKO-neŭronoj ne estis trafitaj (Figuro 2, J kaj K). Resumante, ĉi tiuj rezultoj indikas, ke PN-oj kun evidenta OXPHOS-misfunkcio povas bone trakti altfrekvencajn malŝarĝajn padronojn, indikante, ke ekzistas kompensmekanismo, kiu permesas al ili konservi preskaŭ normalajn elektrofiziologiajn respondojn.
Datumoj estas esprimitaj kiel meznombro ± SEM (unudirekta variancanalizo, plurkompara testo de Holm-Sidak; *P<0,05). La unuonumero estas indikita per krampoj.
Ni celis esplori ĉu iu ajn kategorio en la proteomika datumbazo (Figuro 1G) inkluzivas vojojn, kiuj povas kontraŭagi severan OXPHOS-mankon, tiel klarigante kial trafita PN povas konservi preskaŭ normalan elektrofiziologion (Figuro 2, E ĝis K). Proteomika analizo montris, ke la enzimoj implikitaj en la katabolo de branĉitaj aminoacidoj (BCAA) estis signife plialtigitaj (Figuro 3A kaj Figuro S5A), kaj la fina produkto acetil-CoA (CoA) aŭ sukcinila CoA povas kompletigi la trikarboksilatojn en la arterioskleroza acido (TCA) ciklo. Ni trovis, ke la enhavo de BCAA-transaminazo 1 (BCAT1) kaj BCAT2 ambaŭ pliiĝis. Ili katalizas la unuan paŝon de BCAA-katabolo per generado de glutamato el α-ketoglutarato (26). Ĉiuj subunuoj, kiuj konsistigas la branĉitan ĉenan ketoacidan dehidrogenazon (BCKD) komplekson, estas suprenreguligitaj (la komplekso katalizas la postan kaj nereverteblan dekarboksiligon de la rezulta BCAA-karbona skeleto) (Figuro 3A kaj Figuro S5A). Tamen, neniuj evidentaj ŝanĝoj en BCAA mem estis trovitaj en la ordigita PN, kio povas ŝuldiĝi al la pliigita ĉela sorbado de ĉi tiuj esencaj aminoacidoj aŭ la uzo de aliaj fontoj (glukozo aŭ lakta acido) por kompletigi la TCA-ciklon (Figuro S5B). PN-oj sen OXPHOS ankaŭ montris pliigitajn glutaminajn malkomponiĝojn kaj transaminigajn agadojn je 8 semajnoj de aĝo, kio povas esti reflektita per la suprenreguligo de la mitokondriaj enzimoj glutaminazo (GLS) kaj glutamina piruvata transaminazo 2 (GPT2) (Figuro 3, A kaj C). Indas rimarki, ke la pliigo de GLS limiĝas al la splisita izoformo glutaminazo C (GLS-GAC) (la ŝanĝo de Mfn2cKO/CTRL estas proksimume 4,5-obla, P = 0,05), kaj ĝia specifa pliigo en kanceraj histoj povas subteni mitokondrian bioenergion. (27)
(A) La varmomapo montras la ŝanĝon en la proteina nivelo por la specifita vojo je 8 semajnoj. (B) Ekzemplo de cerebela tranĉaĵo markita per kontraŭ-PCx-antikorpo (skalbreto, 20 μm). La flava sago montras al la Purkinje-ĉelkorpo. (C) Analizo de proteina esprimo laŭ tempodaŭro identigita kiel grava kandidato por aterosklerozo (multobla t-testo, *FDR <5%; n = 3-5 musoj). (D) Supre: Skema diagramo montranta la malsamajn manierojn eniri la markitan karbonon enhavitan en la [1-13C]piruvata spurilo (t.e., per PDH aŭ trans-arteria vojo). Malsupre: La violona diagramo montras la procenton de unu-markita karbono (M1) konvertita al asparta acido, citrata acido kaj malata acido post markado de akutaj cerebelaj tranĉaĵoj per [1-13C]piruvato (parigita t-testo; ** P <0,01). (E) Ampleksa tempa historia analizo de la indikita vojo. Konsideru nur proteinojn kun P<0,05 je 8 semajnoj. Punktetita linio: neniu alĝustiga valoro (dudirekta variancoanalizo; * P <0,05; *** P <0,001). Datumoj estas esprimitaj kiel meznombro±SEM.
En nia analizo, la katabolo de BCAA fariĝis unu el la ŝlosilaj suprenregulaj vojoj. Ĉi tiu fakto forte sugestas, ke la ventola volumeno eniranta la TCA-ciklon povus esti ŝanĝita en PN sen OXPHOS. Ĉi tio povus reprezenti gravan formon de neŭrona metabola rekonektado, kiu povus havi rektan efikon sur neŭrona fiziologio kaj supervivo dum la bontenado de severa OXPHOS-misfunkcio. Konforme al ĉi tiu hipotezo, ni trovis, ke la ĉefa kontraŭ-ateroskleroza enzimo PCx estas suprenreguligita (Mfn2cKO/CTRL ŝanĝiĝas proksimume 1.5 fojojn; Figuro 3A), kiu katalizas la konvertiĝon de piruvato al oksaloacetato (28), kiu supozeble estas en cerba histo. La esprimo en estas limigita al astrocitoj (29, 30). Konforme al la proteomikaj rezultoj, konfokusa mikroskopio montris, ke la esprimo de PCx estis specife kaj signife pliigita en OXPHOS-mankaj PN-oj, dum PCx-reaktiveco estis ĉefe limigita al la apudaj Bergmann-gliaj ĉeloj de la kontrolo (Figuro 3B). Por funkcie testi la observitan suprenreguligon de PCx, ni traktis akutajn cerebelajn tranĉaĵojn per [1-13C]piruvata spurilo. Kiam piruvato estis oksidigita per piruvata dehidrogenazo (PDH), ĝia izotopa etikedo malaperis, sed ĝi estas enigita en la TCA-ciklajn intermediatojn kiam piruvato estas metaboligita per angiaj reakcioj (Figuro 3D). Subtenante niajn proteomikajn datumojn, ni observis grandan nombron da markiloj de ĉi tiu spurilo en la asparta acido de Mfn2cKO-tranĉaĵoj, dum citrata acido kaj malata acido ankaŭ havis moderan tendencon, kvankam ne signifan (Figuro 3D).
En la dopaminaj neŭronoj de MitoPark-musoj kun mitokondria misfunkcio kaŭzita de dopaminaj neŭronoj specife detruantaj la mitokondrian transkripcifaktoron A-genon (Tfam) (Figuro S6B), la esprimo de PCx ankaŭ estis signife plireguligita (31), indikante ke la okazo de la malsano estas reguligita dum la misfunkcio de neŭrona OXPHOS en la korpo. Indas rimarki, ke oni trovis, ke unikaj enzimoj (32-34), kiuj eble esprimiĝas en neŭronoj, kiuj eble estas asociitaj kun arteriosklerozo, estas signife plireguligitaj en PN-oj mankantaj OXPHOS, kiel ekzemple propionil-CoA-karboksilazo (PCC-A), Malonil-CoA konvertas propionil-CoA al sukcinil-CoA kaj mitokondria mala enzimo 3 (ME3), kies ĉefa rolo estas reakiri piruvaton el malato (Figuro 3, A kaj C) (33, 35). Krome, ni trovis signifan pliiĝon en la enzimo Pdk3, kiu fosforiligas kaj tiel malaktivigas PDH (36), dum neniuj ŝanĝoj estis detektitaj en la enzimo Pdp1, kiu aktivigas PDH, aŭ la PDH-enziman komplekson mem (Figuro 3A). Konstante, en Mern2cKO PN-oj, la fosforiligo de la α1-subunuo α (PDHE1α) subunuo de la piruvata dehidrogenaza E1-komponanto de la PDH-komplekso en Ser293 (sciite inhibicii la enziman aktivecon de PDH) estis plifortigita (Figuro S6C) (Figuro S6C). Piruvato ne havas vaskulan aliron.
Fine, ni trovis, ke la supervojo de serino kaj glicino biosintezo, la rilata mitokondria folato- (1C) ciklo kaj prolino biosintezo (Figuro 1G kaj Figuro S5C) estas ĉiuj signife plireguligitaj, laŭ raportoj, dum la aktiviga procezo. La ĉirkaŭaj histoj estas aktivigitaj kun mitokondria misfunkcio (5-7). Konfokusa analizo subtenanta ĉi tiujn proteomikajn datumojn montris, ke en PN kun OXPHOS mankanta, cerebelaj tranĉaĵoj de 8-semajnaj musoj estis submetitaj al serina hidroksimetiltransferazo 2 (SHMT2), ŝlosila enzimo de la mitokondria folato-ciklo. Signifa imunreago (Figuro S5D). En 13 CU-glukozo-inkubitaj akutaj cerebelaj tranĉaĵoj, metabolaj spuraj eksperimentoj plue konfirmis la plireguligon de serino kaj prolino biosintezo, indikante, ke la fluo de karbonaj izoformoj en serinon kaj prolinon pliiĝis (Figuro S5E). Ĉar la reakcioj antaŭenigitaj de GLS kaj GPT2 respondecas pri la sintezo de glutamato el glutamino kaj la transaminigo inter glutamato kaj α-ketoglutarato, ilia suprenregulado indikas, ke OXPHOS-mankhavaj neŭronoj havas pliigitan bezonon je glutamato. Ĉi tio eble celas konservi la pliigitan biosintezon de prolino (Figuro S5C). Kontraste al ĉi tiuj ŝanĝoj, proteomika analizo de cerebelaj astrocitoj de PN-specifaj Mfn2cKO-musoj montris, ke ĉi tiuj vojoj (inkluzive de ĉiuj antiperoksidazoj) ne ŝanĝiĝis signife en esprimo, tiel montrante, ke ĉi tiu metabola alidirektado estas selektema al degradita PN (Figuro S6, D ĝis G).
Resumante, ĉi tiuj analizoj rivelis signife malsamajn ŝablonojn de tempa aktivigo de specifaj metabolaj vojoj en PN-oj. Kvankam nenormala neŭrona mitokondria funkcio povas konduki al frua aterosklerozo kaj 1C-remodelado (Figuro 3E kaj Figuro S5C), kaj eĉ antaŭvideblaj ŝanĝoj en la esprimo de I kaj IV-kompleksoj, la ŝanĝoj en serinaj de novo-sintezo estas nur evidentaj en la malfruaj stadioj. OXPHOS-misfunkcio (Figuro 3E kaj Figuro S5C). Ĉi tiuj trovoj difinas sinsekvan procezon, en kiu la streso-induktitaj mitokondriaj (1C-ciklo) kaj citoplasmaj (serina biosintezo) respondas sinergie kun la pliiĝo de aterosklerozo en la TCA-ciklo por transformi neŭronan metabolon.
8-semajnaj OXPHOS-mankhavaj PN-oj povas konservi alt-frekvencan ekscitan agadon kaj sperti signifan metabolan rekonekton por kompensi mitokondrian misfunkcion. Ĉi tiu malkovro levas interesan eblecon, ke eĉ nuntempe, ĉi tiuj ĉeloj ankaŭ povus ricevi terapian intervenon por prokrasti aŭ malhelpi neŭrodegeneradon. Malfrue. Ni solvis ĉi tiun eblecon per du sendependaj intervenoj. En la unua metodo, ni desegnis Cre-dependan adeno-asociitan virusan (AAV) vektoron, tiel ke MFN2 povas esti selekteme esprimita en OXPHOS-mankhavaj PN-oj in vivo (Figuro S7A). La AAV kodanta MFN2 kaj la fluoreska raportista geno mCherry (Mfn2-AAV) estis kontrolitaj en primaraj neŭronkulturoj in vitro, kio kaŭzis, ke MFN2 estis esprimita laŭ Cre-dependa maniero kaj savis la mitokondrian morfologion, tiel malhelpante neŭromutacion en Mfn2cKO-neŭronoj (Figuro S7, B, D kaj E). Poste, ni faris en vivajn eksperimentojn por stereotakse liveri 8-semajn-aĝan Mfn2-AAV al la cerebela kortekso de Mfn2cKO- kaj kontrolmusoj, kaj analizis 12-semajn-aĝajn musojn (Figuro 4A). La traktitaj Mfn2cKO-musoj mortis (Figuro 1, A kaj B) (16). Virusa transdukto en vivo rezultigis selektivan esprimon de PN en iuj cerebelaj cirkloj (Figuro S7, G kaj H). La injekto de la kontrola AAV esprimanta nur mCherry (Ctrl-AAV) ne havis signifan efikon sur la grado de neŭrodegenerado en Mfn2cKO-bestoj. Kontraste, la analizo de Mfn2cKO-oj transduktitaj per Mfn2-AAV montris signifan protektan efikon de la PN-ĉeltavolo (Figuro 4, B kaj C). Aparte, la neŭrona denseco ŝajnas esti preskaŭ nedistingebla de la kontrolbestoj (Figuro 4, B kaj C, kaj Figuro S7, H kaj I). La esprimo de MFN1 sed ne de MFN2 estas same efika por savi neŭronan morton (Figuro 4C kaj Figuro S7, C kaj F), kio indikas, ke la esprimo de ektopa MFN1 povas efike kompletigi la mankon de MFN2. Plia analizo je la nivelo de ununura PN montris, ke Mfn2-AAV plejparte savis la ultrastrukturon de mitokondrioj, normaligis mtDNA-nivelojn, kaj inversigis la altan esprimon de la kontraŭ-angiogeneza markilo PCx ​​(Figuro 4, C ĝis E). Vida inspektado de la savitaj Mfn2cKO-musoj en ripoza stato montris, ke ilia pozo kaj motoraj simptomoj (movado S1 ĝis S3) pliboniĝis. Konklude, ĉi tiuj eksperimentoj montras, ke malfrua reenkonduko de MFN2 en PN-ojn grave mankhavajn je OXPHOS sufiĉas por inversigi mtDNA-konsumon kaj indukti aterosklerozon, tiel malhelpante aksonan degeneron kaj neŭronan morton in vivo.
(A) Skemo montranta la eksperimentan horaron por injekti AAV kodantan MFN2 kiam la indikita metabola vojo estas aktivigita. (B) Reprezentaj konfokusaj bildoj de 12-semajnaj cerebelaj tranĉaĵoj transduktitaj je 8 semajnoj en Mfn2cKO-musoj kaj markitaj per kontraŭ-Calbindin-antikorpo. Dekstre: Skaliĝo de aksonaj fibroj. La skalo de la aksona zumo estas 450 kaj 75 μm. (C) Maldekstre: Kvantigo de Purkinje-ĉela denseco en la AAV-transdukta buklo (AAV+) (unudirekta variancanalizo; n = 3 musoj). Dekstre: mtDNA-fokusanalizo en transduktita PN je semajno 12 (nepara t-testo; n = 6 ĉeloj de tri musoj). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Reprezentaj transmisiaj elektronaj mikrografoj de PN-oj de Mfn2cKO-cerebelaj sekcioj transduktitaj per la indikitaj virusvektoroj. La rozkolora masko ilustras la areon okupitan de dendritoj, kaj la flava punktita kvadrato ilustras la zomon montritan dekstre; n reprezentas la nukleon. Skalbreto, 1 μm. (E) montras ekzemplon de PCx-kolorigo en PN transduktita je 12 semajnoj. Skalbreto, 20 μm. OE, troesprimo; FC, faldŝanĝo.
Fine, ni esploris la gravecon de peroksidazo-induktita ĉelsupervivo en PN-oj, kiuj spertis OXPHOS-misfunkcion. Ni generis mCherry-on, kiu kodas AAV-shRNA (mallonga harpingla RNA) specife celante musan PCx-mRNA (AAV-shPCx), kaj injektis la viruson aŭ ĝian miksitan kontrolon (AAV-scr) en la cerebelon de Mfn2cKO-musoj. La injekto estis farita en la kvara semajno de aĝo (Figuro 5A) por atingi efikan PCx-subpremon dum la periodo, kiam PCx-esprimo pliiĝis (Figuro 3C) kaj la PN-ĉeltavolo ankoraŭ estis sendifekta (Figuro 1A). Indas rimarki, ke subpremo de PCx (Figuro S8A) kondukas al signifa akcelo de PN-morto, kiu limiĝas al la infektita ringo (Figuro 5, B kaj C). Por kompreni la mekanismon de la metabolaj efikoj induktitaj de PCx-pliiĝo, ni studis la redoksan staton de PN-oj post PCx-malsuprenreguligo kaj AAV-mediaciita optika biosensilo Grx1-roGFP2 estis samtempe esprimitaj (Figuro S8, B ĝis D) por taksi la relativan ŝanĝon de la peptida redoksa potencialo de glutationo (38). Poste, ni efektivigis du-fotonan fluoreskan dumvivan bildigan mikroskopion (FLIM) en akutaj cerbaj tranĉaĵoj de 7-semajna Mfn2cKO aŭ kontrolaj samnaskitaj ŝablonoj por detekti eblajn ŝanĝojn en la citoplasma redoksa stato post kontrolado de FLIM-kondiĉoj (Figuro S8, E ĝis G). La analizo montris signifan pliiĝon en la oksidiĝa stato de unuopaj Mfn2cKO PN-oj sen PCx-esprimo, kio diferencas de kontrolaj neŭronoj aŭ Mfn2cKO PN-oj esprimantaj nur miksitan shRNA-on (Figuro 5, D kaj E). Kiam la esprimo de PCx estis malsuprenreguligita, la procento de Mfn2cKO PN-oj montrantaj tre oksiditan staton pliiĝis pli ol trioble (Figuro 5E), indikante ke la suprenreguligo de PCx konservis la redoksan kapaciton de degeneritaj neŭronoj.
(A) Skemo montranta la eksperimentan horaron por injekti AAV-kodantan shPCx kiam la indikita metabola vojo estas aktivigita. (B) Reprezentaj konfokusaj fotoj de 8-semajnaj cerebelaj sekcioj en Mfn2cKO-musoj transduktitaj kaj markitaj per kontraŭ-kalcineŭrina antikorpo je 4 semajnoj. Skalbreto, 450μm. (C) Kvantigo de Purkinje-ĉela denseco en AAV-transduktitaj bukloj (unudirekta variancoanalizo; n = 3 ĝis 4 musoj). Datumoj estas esprimitaj kiel meznombro±SEM; ***P<0.001. (D) Reprezenta FLIM-bildo montras la averaĝan vivdaŭron de 7-semajna PN-esprimanta glutationan redoksan sensilon Grx1-roGFP2 sub la specifitaj eksperimentaj kondiĉoj. LUT (konserva tabelo) proporcio: superviva tempintervalo (en pikosekundoj). Skalbreto, 25μm. (E) La histogramo montras la distribuon de vivdaŭraj valoroj de Grx1-roGFP2 el (D) (n=158 ĝis 368 ĉeloj en du musoj sub ĉiu kondiĉo). La cirklodiagramo super ĉiu histogramo montras la nombron da ĉeloj kun signife pli longaj (ruĝaj, oksiditaj) aŭ pli mallongaj (bluaj, reduktitaj) vivdaŭraj valoroj, kiuj superas 1 norman devio de la meza vivdaŭra valoro per CTRL-AAV-scr. (F) La proponita modelo montras la protektan efikon de pliigo de neŭrona PCx.
Entute, la datumoj, kiujn ni provizas ĉi tie, montras, ke la reesprimo de MFN2 povas tute savi progresintan PN kun severa OXPHOS-manko, severa mtDNA-malplenigo, kaj ekstreme nenormala ista-simila morfologio, tiel provizante kontinuan progreson eĉ en progresintaj malsanoj. Neŭrodegenerado provizas inversigeblan pruvon pri la stadio antaŭ ĉelmorto. Ĉi tiu grado de metabola fleksebleco estas plue emfazita per la kapablo de neŭronoj indukti aterosklerozon (rekonekto de la TCA-ciklo), kiu inhibas PCx-esprimon en PN-oj malhavantaj OXPHOS kaj plifortigas ĉelmorton, tiel ludante protektan rolon (Figuro 5F).
En ĉi tiu studo, ni provizis pruvojn, ke la respondo de PN-oj al OXPHOS-misfunkcio estas iom post iom konverĝi al TCA-cikla aterosklerozo tra la diferenciga aktiviga vojo aktivigita de metabolaj programoj. Ni konfirmis la proteomikan analizon per multaj komplementaj metodoj kaj malkaŝis, ke kiam defiitaj de severa mitokondria misfunkcio, neŭronoj havas antaŭe nekonatan formon de metabola elasteco. Al nia surprizo, la tuta rekonekta procezo ne nepre markas la finan metabolan staton, kiu akompanas neŭrodegeneron iom post iom kaj nerevokeble, sed niaj datumoj sugestas, ke ĝi povus konsistigi funkcian kompensan mekanismon por konservado de neŭronoj eĉ en la stadio antaŭ ĉelmorto. Ĉi tiu trovo indikas, ke neŭronoj havas konsiderindan gradon da metabola plastikeco en la korpo. Ĉi tiu fakto pruvas, ke la pli posta reenkonduko de MFN2 povas inversigi la esprimon de ŝlosilaj metabolaj indikiloj kaj malhelpi PN-degeneron. Male, ĝi inhibicias aterosklerozon kaj akcelas la nervojn transseksajn.
Unu el la plej fascinaj trovoj en nia esplorado estas, ke PN-oj sen OXPHOS povas modifi la TCA-ciklan metabolon per suprenregulado de enzimoj, kiuj specife stimulas arteriosklerozon. Metabola rearanĝo estas ofta trajto de kanceraj ĉeloj, el kiuj kelkaj dependas de glutamino por kompletigi TCA-ciklajn intermediatojn por produkti reduktantajn ekvivalentojn, kiuj pelas la spiran ĉenon kaj subtenas la produktadon de lipidaj kaj nukleotidaj biosintezaj antaŭuloj (39, 40). Lastatempa studo montris, ke en periferiaj histoj spertantaj OXPHOS-misfunkcion, la rekonekto de glutamino/glutamata metabolo ankaŭ estas elstara trajto (5, 41), kie la direkto de glutamino-eniro en la TCA-ciklon dependas de la severeco de OXPHOS-vundo (41). Tamen, mankas klara evidenteco pri iu ajn simileco de neŭrona metabola plastikeco en la korpo kaj ĝia ebla graveco en la malsankunteksto. En lastatempa in vitro studo, primaraj kortikaj neŭronoj pruviĝis mobilizi glutamatajn rezervujojn por neŭrotransmiso, tiel antaŭenigante oksidativan metabolon kaj aterosklerozon sub metabolaj streskondiĉoj (42). Indas rimarki, ke sub la farmakologia inhibicio de la TCA-cikla enzimo sukcinato-dehidrogenazo, oni kredas, ke piruvata karboksiligo subtenas la sintezon de oksaloacetato en kultivitaj cerebelaj granulaj neŭronoj (34). Tamen, la fiziologia graveco de ĉi tiuj mekanismoj por cerba histo (kie oni kredas, ke aterosklerozo estas ĉefe limigita al astrocitoj) ankoraŭ havas gravan fiziologian signifon (43). En ĉi tiu kazo, niaj datumoj montras, ke PN-oj difektitaj de OXPHOS en la korpo povas esti ŝanĝitaj al BCAA-degradado kaj piruvata karboksiligo, kiuj estas la du ĉefaj fontoj de suplementado de TCA-naĝejaj intermediatoj. Kvankam la supozebla kontribuo de BCAA-katabolo al neŭrona energi-metabolo estis proponita, aldone al la rolo de glutamato kaj GABA por neŭrotransmiso (44), ankoraŭ ne ekzistas pruvoj por ĉi tiuj mekanismoj in vivo. Tial, estas facile konjekti, ke misfunkciaj PN-oj povas aŭtomate kompensi la konsumon de TCA-intermediatoj pelitaj de la asimila procezo per kreskanta aterosklerozo. Aparte, pliigo de PCx povas esti necesa por konservi pliigitan bezonon de asparta acido, kio estas sugestita en proliferantaj ĉeloj kun mitokondria misfunkcio (45). Tamen, nia metabolomika analizo ne rivelis iujn ajn signifajn ŝanĝojn en la ekvilibro-nivelo de asparta acido en Mfn2cKO PN-oj (Figuro S6A), kio supozeble reflektas la malsaman metabolan utiligon de asparta acido inter proliferantaj ĉeloj kaj post-mitozaj neŭronoj. Kvankam la preciza mekanismo de pliigo de PCx en misfunkciaj neŭronoj in vivo restas karakterizenda, ni montris, ke ĉi tiu trofrua respondo ludas gravan rolon en konservado de la redoksa stato de neŭronoj, kio estis montrita en FLIM-eksperimentoj sur cerebelaj tranĉaĵoj. Aparte, malhelpi PN-ojn pliigi PCx povas konduki al pli oksidita stato kaj akceli ĉelmorton. La aktivigo de BCAA-degradado kaj la karboksiligo de piruvato ne estas manieroj karakterizi la periferiajn histojn kun mitokondria misfunkcio (7). Tial, ili ŝajnas esti prioritata trajto de OXPHOS-mankhavaj neŭronoj, eĉ se ne la sola trajto, kiu gravas por neŭrodegenerado. .
Cerebela malsano estas heterogena tipo de neŭrodegenera malsano, kiu kutime manifestiĝas kiel ataksio kaj ofte difektas PN-ojn (46). Ĉi tiu neŭrona populacio estas precipe vundebla al mitokondria misfunkcio, ĉar ilia selektema degenero en musoj sufiĉas por reprodukti multajn el la motoraj simptomoj, kiuj karakterizas homan spinocerebelan ataksion (16, 47, 48). Laŭ raportoj, transgena musmodelo kun mutacia geno estas asociita kun homa spinocerebela ataksio kaj havas mitokondrian misfunkcion (49, 50), emfazante la gravecon de studado de la sekvoj de OXPHOS-manko en PNPH. Tial, estas precipe taŭga efike izoli kaj studi ĉi tiun unikan neŭronan populacion. Tamen, ĉar PN-oj estas tre sentemaj al premo kaj konsistigas malaltan proporcion de la tuta cerebela ĉelpopulacio, por multaj omiko-bazitaj studoj, selektema apartigo de ili kiel tutaj ĉeloj estas ankoraŭ malfacila aspekto. Kvankam estas preskaŭ neeble atingi absolutan mankon de poluado de aliaj ĉeltipoj (precipe plenkreskaj histoj), ni kombinis efikan disociigan paŝon kun FACS por akiri sufiĉan nombron da vivkapablaj neŭronoj por posta proteomika analizo, kaj havas sufiĉe altan proteinan kovradon (ĉirkaŭ 3000 proteinoj) kompare kun la ekzistanta datumbazo de la tuta cerebelo (51). Konservante la viveblecon de tutaj ĉeloj, la metodo, kiun ni provizas ĉi tie, permesas al ni ne nur kontroli la ŝanĝojn en la metabolaj vojoj en la mitokondrioj, sed ankaŭ kontroli la ŝanĝojn en ĝiaj citoplasmaj ekvivalentoj, kio kompletigas la uzon de mitokondriaj membranetikedoj por riĉigi la ĉeltipon. La nova metodo por la nombro da mitokondrioj en kompleksaj histoj (52, 53). La metodo, kiun ni priskribas, ne nur rilatas al la studo de Purkinje-ĉeloj, sed povas esti facile aplikita al iu ajn tipo de ĉelo por trakti metabolajn ŝanĝojn en malsanaj cerboj, inkluzive de aliaj modeloj de mitokondria misfunkcio.
Fine, ni identigis terapian fenestron dum ĉi tiu metabola rearanĝoprocezo, kiu povas tute inversigi la ŝlosilajn signojn de ĉela streso kaj malhelpi neŭronan degeneron. Tial, kompreni la funkciajn implicojn de la ĉi tie priskribita rekonektado povus provizi fundamentajn komprenojn pri eblaj traktadoj por konservi neŭronan viveblecon dum mitokondria misfunkcio. Estonta esplorado celanta dissekci ŝanĝojn en energimetabolo en aliaj cerbaj ĉeltipoj estas necesa por plene malkaŝi la aplikeblecon de ĉi tiu principo al aliaj neŭrologiaj malsanoj.
Musoj MitoPark jam estis priskribitaj antaŭe (31). Musoj C57BL/6N kun loxP flankantaj Mfn2-genojn jam estis priskribitaj antaŭe (18) kaj krucitaj kun L7-Cre-musoj (23). La rezultantaj duoble heterozygotaj idoj estis poste krucitaj kun homozygotaj Mfn2loxP/Mfn2loxP-musoj por generi Purkinje-specifajn genajn knokaŭtojn por Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). En subaro de pariĝado, la alelo Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) estis enkondukita per pliaj krucigoj (20). Ĉiuj bestaj proceduroj estis faritaj laŭ eŭropaj, naciaj kaj instituciaj gvidlinioj kaj aprobitaj de LandesamtfürNatur de Umwelt kaj Verbraucherschutz, Nordrejn-Vestfalio, Germanio. Besta laboro ankaŭ sekvas la gvidliniojn de la Eŭropa Federacio de Asocioj pri Laboratoriaj Bestosciencoj.
Post narkotado de la cervika dislokigo de la gravedulino, la musa embrio estas izolita (E13). La kortekso estis dissekcita en Ekvilibra Sala Solvaĵo de Hanks (HBSS) suplementita per 10 mM Hepes kaj pasigita sur Modifita Agla Medio de Dulbecco enhavanta papainon (20 U/ml) kaj cisteinon (1μg/ml). La histo estas kovita en DMEM (Ml) kaj disociigita per enzima digestado. [Ml] je 37°C dum 20 minutoj, kaj poste meĥanike muelita en DMEM suplementita per 10% feta bova serumo. La ĉeloj estis semitaj sur vitraj kovrovitroj kovritaj per polilizino je denseco de 2×10⁶ por 6 cm kulturplado aŭ je denseco de 0.5×10⁶ ĉeloj/cm² por bildiga analizo. Post 4 horoj, la medio estis anstataŭigita per Neurobasal serum-libera medio enhavanta 1% B27-aldonaĵon kaj 0.5 mM GlutaMax. La neŭronoj estis poste tenataj je 37°C kaj 5% CO2 dum la tuta eksperimento, kaj nutritaj unufoje semajne. Por indukti rekombinadon in vitro, 3 μl (24-puta kulturplato) aŭ 0,5 μl (24-puta plato) de la jena AAV9-virusa vektoro estis uzataj por trakti neŭronojn en la dua tago in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, katalognumero 105530-AAV9) kaj AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, katalognumero 105545-AAV9).
Musaj Mfn1 kaj Mfn2 komplementaj DNA-oj (akiritaj de Addgene-plasmido #23212 kaj #23213, respektive) estas markitaj per la V5-sekvenco (GKPINPLLGLDST) ĉe la C-finaĵo, kaj estas kunfanditaj kun mCherry en kadro tra la T2A-sekvenco. Grx1-roGFP2 estas donaco de Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Anstataŭigante la tdTomato-kaseton uzante konvenciajn klonadmetodojn, la kaseto estis subklonita en la pAAV-CAG-FLEX-tdTomato-ĉenon (Addgene-referenca numero 28306) por generi pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 kaj pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2-vektorojn. Simila strategio estis uzata por generi la kontrolvektoron pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Por generi la AAV-shPCx-konstrukcion, plasmida AAV-vektoro (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) estas necesa, kiu enhavas la DNA-sekvencon kodantan la shRNA celantan musan PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Sub la kontrolo de la U6-reklamanto, mCherry estas uzata sub la kontrolo de la CMV-reklamanto. La produktado de helpaj AAV-vektoroj estis efektivigita laŭ la instrukcioj de la fabrikanto (Cell Biolabs). Mallonge, uzu transigan plasmidon portantan mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) paseme. Transfekto de 293AAV-ĉeloj - T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) aŭ Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) kodanta genon, kaj ankaŭ kodanta AAV1-kapsidproteinon kaj akcesoran proteinon. Enpaka plasmido, uzante la kalcian fosfatan metodon. La kruda virusa supernatanto estis akirita per frostig-degelaj cikloj en sekglacio/etanola bano kaj lizitaj ĉeloj en fosfata bufrita salakvo (PBS). La AAV-vektoro estis purigita per malkontinua jodiksanola gradienta ultracentrifugado (24 horoj je 32 000 rpm kaj 4 °C) kaj koncentrita uzante Amicon ultra-15 centrifugan filtrilon. La genara titrado de AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 genara kopio (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX estis kiel antaŭe priskribite (54), mezurita per realtempa kvanta PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) kaj AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
Primaraj neŭronoj estis skrapitaj en glacie malvarma 1x PBS, peletitaj, kaj poste homogenigitaj en 0.5% Triton X-100 / 0.5% natria deoksiĥolato/PBS liza bufro enhavanta fosfatazon kaj proteazan inhibitoron (Roche). Proteina kvantigo estis farita per bicinkonina acido-analizo (Thermo Fisher Scientific). La proteinoj estis poste apartigitaj per SDS-poliakrilamida ĝela elektroforezo, kaj poste makulitaj sur polivinilidenfluoridan membranon (GE Healthcare). Bloku nespecifajn lokojn kaj kovu kun la primara antikorpo (vidu Tabelon S1 por detaloj) en 5% lakto en TBST (Tris-bufrita salakvo kun Tween), lavadaj paŝoj kaj sekundara antikorpo en TBST-Inkubacio. Kovu kun primara antikorpo dumnokte je +4°C. Post lavado, apliku la sekundaran antikorpon dum 2 horoj je ĉambra temperaturo. Poste, per kovado de la sama makulo kun kontraŭ-β-aktina antikorpo, la sama ŝarĝo estis konfirmita. Detekto per konvertado al kemiluminesko kaj plifortigado de kemiluminesko (GE Healthcare).
La neŭronoj antaŭe semitaj sur vitraj kovrovitroj estis fiksitaj per 4% paraformaldehido (PFA)/PBS je la specifita tempopunkto je ĉambra temperaturo dum 10 minutoj. La kovrovitroj unue estas trapenetritaj per 0.1% Triton X-100/PBS dum 5 minutoj je ĉambra temperaturo, kaj poste en blokanta bufro [3% bova seruma albumino (BSA)/PBS]. En la dua tago, la kovrovitroj estis lavitaj per blokanta bufro kaj inkubaciitaj kun la taŭga fluoroforo-konjugita sekundara antikorpo dum 2 horoj je ĉambra temperaturo; fine, la specimenoj estis lavitaj plene en PBS kun 4′,6-diamidino-2-Fenilindolo (DAPI) estas kontraŭkolorigita kaj poste fiksita sur la mikroskopa vitraĵo per Aqua-Poly/Mount.
Musoj (maskloj kaj inoj) estis narkotitaj per intraperitonea injekto de ketamino (130 mg/kg) kaj ksilazino (10 mg/kg) kaj subhaŭte administritaj kun carprofena kontraŭdolorilo (5 mg/kg), kaj metitaj en stereotaksan instrumenton (Kopf) ekipitan per varma kuseneto. Malkovru la kranion kaj uzu dentan borilon por maldensigi la parton de la cerebela kortekso korespondantan al la mis-osto (de lambdo: vosto 1.8, laterala 1, korespondanta al lobuloj IV kaj V). Uzu kurban injektilpinglon por zorge krei malgrandan truon en la kranio por eviti interrompi la vaskularon sube. Poste la maldika tirita vitra kapilaro estas malrapide enigita en la mikro-truon (de -1.3 ĝis -1 sur la ventra flanko de la duramatro), kaj 200 ĝis 300 nl de AAV estas injektitaj en la mikro-injektilon (Narishige) per manaj injektiloj (Narishige) plurfoje je malalta premo dum periodo de 10 ĝis 20 minutoj. Post la infuzaĵo, metu la kapilaron dum pliaj 10 minutoj por permesi al la viruso disvastiĝi tute. Post kiam la kapilaroj estas retiritaj, la haŭto estas zorge suturita por minimumigi vundinflamon kaj permesi al la besto resaniĝi. La bestoj estis traktitaj per kontraŭdoloriloj (kaspofeno) dum pluraj tagoj post la operacio, dum kiuj tempo ilia fizika stato estis zorge monitorita kaj poste ili estis eŭtanaziigitaj je la difinita tempo. Ĉiuj proceduroj estis efektivigitaj laŭ eŭropaj, naciaj kaj instituciaj gvidlinioj kaj estis aprobitaj de LandesamtfürNatur de Umwelt kaj Verbraucherschutz, Nordrejn-Vestfalio, Germanio.
La bestoj estis anestezitaj per ketamino (100 mg/kg) kaj ksilazino (10 mg/kg), kaj la koro estis unue perfuzita per 0.1 M PBS, kaj poste per 4% PFA en PBS. La histo estis dissekcita kaj fiksita en 4% PFA/PBS dumnokte je 4°C. Vibra tranĉilo (Leica Microsystems GmbH, Vieno, Aŭstrio) estis uzata por prepari sagitalajn sekciojn (50 μm dikajn) el la fiksita cerbo en PBS. Krom se alie specifite, tinkturado de libere ŝvebantaj sekcioj estis farita kiel priskribite supre (13) je ĉambra temperaturo kaj kirlado. Mallonge, unue, la akiritaj tranĉaĵoj estis permeabligitaj per 0.5% Triton X-100/PBS dum 15 minutoj je ĉambra temperaturo; por kelkaj epitopoj (Pcx kaj Shmt2), per varmigo en tris-EDTA bufro je 80°C (PH 9) la tranĉaĵoj dum 25 minutoj anstataŭ ĉi tiu paŝo. Poste, la sekcioj estis inkubaciitaj kun primara antikorpo (vidu Tabelon S1) en blokanta bufro (3% BSA/PBS) je 4°C dumnokte kun kirlado. La sekvan tagon, la sekcioj estis lavitaj per blokanta bufro kaj inkubaciitaj kun la taŭga fluoroforo-konjugita sekundara antikorpo dum 2 horoj je ĉambra temperaturo; fine, la sekcioj estis lavitaj plene en PBS, kontraŭkolorigitaj per DAPI, kaj poste fiksitaj per AquaPolymount sur mikroskopa glitplato.
Lasera skana konfokusa mikroskopo (TCS SP8-X aŭ TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) ekipita per blanka luma lasero kaj 405-dioda ultraviola lasero estis uzata por bildigi la specimenon. Ekscitante la fluoroforon kaj kolektante la signalon per Hibrida Detektilo (HyDs), la programaro LAS-X estis uzata por kolekti staplitajn bildojn konformajn al Nyquist-specimenado en sinsekva reĝimo: por ne-kvantaj paneloj, temas pri tre dinamikaj signaloj (ekzemple, en somataj ĉeloj kaj dendritoj) (mtYFP) Uzu HyD por detekti la nombron de PN-oj en BrightR-reĝimo. Pordo de 0.3 ĝis 6 ns estas aplikita por redukti la fonon.
Realtempa bildigo de ordigitaj ĉeloj. Post ordigo en Neurobasal-A medio enhavanta 1% B27-aldonaĵon kaj 0.5 mM GlutaMax, la ĉeloj estis tuj semitaj sur poli-l-lizino-kovritaj vitraj lametoj (μ-Slide8 Well, Ibidi, katalognumero 80826), kaj poste konservitaj je 37°C kaj 5% CO2 dum 1 horo por permesi al la ĉeloj sedimentiĝi. Realtempa bildigo estis farita per Leica SP8 lasera skana konfokusa mikroskopo ekipita per blanka lasero, HyD, 63×[1.4 numera aperturo (NA)] olea objektiva lenso kaj hejtilo.
La muso estis rapide narkotita per karbondioksido kaj senkapigita, la cerbo estis rapide forigita de la kranio, kaj tranĉita en 200μm dikajn (por 13C-markada eksperimento) aŭ 275μm dikajn (por dufotonaj eksperimentoj) sagitalajn sekciojn plenigitajn per la jenaj materialoj. La glaciaĵo (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germanio) estas plenigita per la jenaj substancoj: 125 mM glacimalvarma, karbon-saturita (95% O2 kaj 5% CO2) malalt-Ca2 + artefarita cerbo-spina likvaĵo (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natria fosfata bufro, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukozo, 0.5 mM CaCl2 kaj 3.5 mM MgCl2 (osmoza premo de 310 ĝis 330 mmol). Transdonu la akiritajn cerbajn tranĉaĵojn al antaŭ-inkubacia ĉambro enhavanta pli altan Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natria fosfata bufro, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukozo, 1.0 mM CaCl2 kaj 2.0 mM MgCl2) medion) pH 7.4 kaj 310 ĝis 320 mmol).
Dum la bildiga procezo, la tranĉaĵoj estis movitaj en dediĉitan bildigan ĉambron, kaj la eksperimento estis farita sub kontinua ACSF-perfuzado je konstanta temperaturo de 32° ĝis 33°C. Multifotona lasera skana mikroskopo (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) ekipita per Leica 25x objektiva lenso (NA 0.95, akvo), Ti:Safira lasero (Chameleon Vision II, Coherent) estis uzata por tranĉaĵa bildigo. FLIM-modulo (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM de Grx1-roGFP2. La ŝanĝoj en la citoplasma redoksa stato de PN-oj estis mezuritaj per du-fotona FLIM en sagitalaj cerbaj tranĉaĵoj, kie la Grx1-roGFP2 biosensilo celis PN-ojn. En la PN-tavolo, la akira kampo estas elektita ĉirkaŭ 50 ĝis 80 μm sub la tranĉaĵa surfaco por certigi, ke ekzistas vivkapabla PN (tio estas, la manko de perlita strukturo aŭ neŭronaj morfologiaj ŝanĝoj laŭlonge de la dendritoj) kaj la duoble pozitiva roGFP2 sensilo kaj AAV ĉifranta shRNA PCx aŭ ĝian kontrolsekvencon (ĉiu kunesprimante mCherry). Kolektu unu-stakajn bildojn per 2x cifereca zumo [ekscita ondolongo: 890 nm; 512 nm 512 pikseloj]. Detekto: interna HyD, fluoresceina izotiocianata (FITC) filtrilgrupo] kaj bildaveraĝo ene de 2 ĝis 3 minutoj estas uzataj por certigi, ke sufiĉe da fotonoj estas kolektitaj (1000 fotonoj entute) por kurba alĝustigo. La sentemo de la Grx1-roGFP2-sondilo kaj la konfirmo de FLIM-kondiĉoj estis efektivigitaj per monitorado de la vivdaŭro de roGFP2 dum aldono de eksogena 10 mM H2O2 al la perfuza ACSF (por maksimumigi oksidiĝon, rezultante en plilongigita vivdaŭro), kaj poste aldono de 2 mM ditiotreitolo (minimumigas la gradon de redukto, rezultante en malkresko de la vivdaŭro) (Figuro S8, D ĝis G). Uzu la programaron FLIMfit 5.1.1 por analizi la akiritajn rezultojn, alĝustigu la unuopan eksponentan kadukiĝan kurbon de la tuta bildo al la mezurita IRF (instrumenta respondofunkcio), kaj χ2 estas proksimume 1. Por kalkuli la vivdaŭron de unuopa PN, la masko ĉirkaŭ la nervokorpo estis mane desegnita, kaj la meza vivdaŭro en ĉiu masko estis uzata por kvantigo.
Analizo de mitokondria potencialo. Post kiam la akuta sekcio estis inkubaciita kun 100 nM TMRM rekte aldonita al la perfuzita ACSF dum 30 minutoj, la ŝanĝoj en mitokondria potencialo de PN-oj estis mezuritaj per du-fotona mikroskopo. TMRM-bildigo estis farita per ekscitado de la sondilo je 920 nm kaj uzante internan HyD (tetrametilrodamina izotiocianato: 585/40 nm) por kolekti signalojn; uzante la saman ekscitan ondolongon sed uzante malsaman internan HyD (FITC: 525/50) por bildigi mtYFP. Uzu la kromprogramon Image Calculator de ImageJ por taksi mitokondrian potencialon je la nivelo de unuopa ĉelo. Mallonge, la kromprogramo-ekvacio: signal = min (mtYFP, TMRM) estas uzata por identigi la mitokondrian regionon, kiu montras la TMRM-signalon en Purkinje Somali en la unu-staka konfokusa bildo de la koresponda kanalo. Tiam la piksela areo en la rezulta masko estas kvantigita, kaj poste normaligita sur la koresponda sojla unu-staka bildo de la mtYFP-kanalo por akiri la mitokondrian frakcion montrantan la mitokondrian potencialon.
La bildo estis malkonvoluita per la programaro Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Por la skanitaj bildoj de kaheloj, la muntado de unuopa kahelo estas farita uzante la aŭtomatan kudran algoritmon provizitan de la programaro LAS-X. Post la bilda kalibrado, uzu ImageJ kaj Adobe Photoshop por plue prilabori la bildon kaj unuforme alĝustigi la brilecon kaj kontraston. Uzu Adobe Illustrator por grafika preparado.
Analizo de mtDNA-fokuso. La nombro de mtDNA-lezoj estis kvantigita sur cerebelaj sekcioj markitaj per antikorpoj kontraŭ DNA per konfokusa mikroskopo. Ĉiu cela areo estis kreita por la ĉelkorpo kaj la nukleo de ĉiu ĉelo, kaj la respektiva areo estis kalkulita per la kromprogramo Multi Measure (programaro ImageJ). Subtrahu la nuklean areon de la ĉelkorpa areo por akiri la citoplasman areon. Fine, la kromprogramo Analyze Particles (programaro ImageJ) estis uzata por aŭtomate kvantigi la citoplasmajn DNA-punktojn indikante mtDNA-on sur la sojla bildo, kaj la akiritaj rezultoj estis normaligitaj al la PN-mezumo de CTRL-musoj. La rezultoj estas esprimitaj kiel la meza nombro de nukleozidoj po ĉelo.
Analizo de proteina esprimo. Uzu la kromprogramon Image Calculator de ImageJ por taksi proteinan esprimon en PN je la nivelo de unuopa ĉelo. Mallonge, en la unu-tavola konfokusa bildo de la koresponda kanalo, per la ekvacio: signalo = min (mtYFP, antikorpo), la mitokondria regiono, kiu montras imunoreaktivecon al certa antikorpo en Purkina, estas identigita. Poste la piksela areo en la rezulta masko estas kvantigita, kaj poste normaligita sur la koresponda sojla unu-staka bildo de la mtYFP-kanalo por akiri la mitokondrian frakcion de la montrita proteino.
Analizo de la denseco de Purkinje-ĉeloj. La kromprogramo Cell Counter de ImageJ estis uzata por taksi la densecon de Purkinje dividante la nombron de kalkulitaj Purkinje-ĉeloj per la longo de la cerebela ringo okupita de la kalkulitaj ĉeloj.
Specimenpreparado kaj kolektado. La cerboj de la kontrolgrupo kaj Mfn2cKO-musoj estis fiksitaj en 2% PFA/2.5% glutaraldehido en 0.1 M fosfata bufro (PB), kaj poste koronaj sekcoj estis preparitaj uzante ciliulojn (Leica Mikrosysteme GmbH, Vieno, Aŭstrio) (dikeco 50 ĝis 60 μm). Poste fiksitaj en PB-bufro en 1% tetraoksido kaj 1.5% kalia ferocianido je ĉambra temperaturo dum 1 horo. La sekcioj estis lavitaj tri fojojn per distilita akvo, kaj poste koloritaj per 70% etanolo enhavanta 1% uranilan acetaton dum 20 minutoj. La sekcioj estis poste senakvigitaj en gradigita alkoholo kaj enigitaj en Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoksirezino (Electron Microscopy Sciences, katalognumero 14040) inter silikon-kovritaj vitraj lameloj, kaj fine je 60°C polimerigitaj en forno dum 48 horoj. La areo de la cerebela kortekso estis selektita kaj 50 nm ultramaldikaj sekcioj estis tranĉitaj per Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vieno, Aŭstrio) kaj prenitaj sur 2×1 mm kupra fendkrado kovrita per polistirena filmo. La sekcioj estis makulitaj per solvaĵo de 4% uranila acetato en H2O dum 10 minutoj, lavitaj per H2O plurfoje, poste per Reynolds-plumba citrato en H2O dum 10 minutoj, kaj poste lavitaj per H2O plurfoje. Mikrografoj estis prenitaj per transmisia elektrona mikroskopo Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Usono) uzante ciferecan fotilon TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, Usono). Germanio.
Por musoj infektitaj per AAV, la cerbo estis apartigita kaj tranĉita en 1 mm dikan sagitalan sekcion, kaj la cerebelo estis ekzamenita per fluoreska mikroskopo por identigi la AAV-infektitan ringon (t.e., mCherry-esprimantan). Nur eksperimentoj, en kiuj AAV-injekto rezultigas tre altan transduktan efikecon de la Purkinje-ĉela tavolo (t.e., preskaŭ la tuta tavolo) en almenaŭ du sinsekvaj cerebelaj ringoj, estas uzataj. La AAV-transduktita buklo estis mikrodissekcita por nokta post-fiksado (4% PFA kaj 2.5% glutaraldehido en 0.1 M kokoata bufro) kaj plue prilaborita. Por EPON-enkorpigo, la fiksita histo estis lavita per 0.1 M natria kokoata bufro (Applicihem), kaj inkubita kun 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) en 0.1 M natria kokoata bufro (Applicihem) dum 4 horoj, poste lavita dum 2 horoj. Ripetu 3 fojojn kun 0.1 M kokamida bufro. Poste, la ascendanta serio de etanolo estis uzata por inkubi ĉiun etanolan solvaĵon je 4°C dum 15 minutoj por senakvigi la histon. La histo estis transdonita al propilena oksido kaj inkubita dumnokte en EPON (Sigma-Aldrich) je 4°C. Metu la histon en freŝan EPON je ĉambra temperaturo dum 2 horoj, kaj poste enmetu ĝin je 62°C dum 72 horoj. Uzu ultramikrotomon (Leica Microsystems, UC6) kaj diamantan tranĉilon (Diatome, Biel, Svislando) por tranĉi 70 nm ultramaldikajn sekciojn, kaj kolorigu per 1.5% uranila acetato dum 15 minutoj je 37°C, kaj kolorigu per plumba citrata solvaĵo dum 4 minutoj. La elektronmikrografoj estis prenitaj uzante JEM-2100 Plus transmisian elektronmikroskopon (JEOL) ekipitan per Camera OneView 4K 16-bita (Gatan) kaj DigitalMicrograph-programaro (Gatan). Por analizo, elektronmikrografoj estis akiritaj per 5000× aŭ 10.000× cifereca zomo.
Morfologia analizo de mitokondrioj. Por ĉiuj analizoj, la konturoj de individuaj mitokondrioj estis mane skizitaj en ciferecaj bildoj uzante la programaron ImageJ. Diversaj morfologiaj parametroj estas analizitaj. Mitokondria denseco estas esprimita kiel procento akirita dividante la tutan mitokondrian areon de ĉiu ĉelo per la citoplasma areo (citoplasma areo = ĉela areo - ĉelnuklea areo) × 100. La rondeco de mitokondrioj estas kalkulita per la formulo [4π∙(areo/perimetro 2)]. La ista morfologio de mitokondrioj estis analizita kaj dividita en du kategoriojn ("tubula" kaj "vezikeca") laŭ iliaj ĉefaj formoj.
Analizo de la nombro kaj denseco de aŭtofagosomoj/lizozomoj. Uzu la programaron ImageJ por permane skizi la konturojn de ĉiu aŭtofagosomo/lizozomo en la cifereca bildo. La areo de la aŭtofagosomo/lizozomo estas esprimita kiel procento, kalkulita dividante la tutan areon de la aŭtofagosomo/lizozomo-strukturo de ĉiu ĉelo per la citoplasma areo (citoplasma areo = ĉela areo - nuklea areo) × 100. La denseco de aŭtofagosomoj/lizozomoj estas kalkulita dividante la tutan nombron per la nombro de aŭtofagosomoj/lizozomoj por ĉelo (laŭ citoplasma areo) (citoplasma areo = ĉela areo - nuklea areo).
Etikedado por akuta sekcado kaj specimenpreparado. Por eksperimentoj kiuj postulas glukozan etikedadon, translokigu la akutajn cerbajn tranĉaĵojn al antaŭ-inkubacia ĉambro, kiu enhavas saturitan karbonon (95% O2 kaj 5% CO2), altan Ca2+ ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natria fosfata bufro, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukozo, 1.0 mM CaCl2 kaj 2.0 mM MgCl2, adaptita al pH 7.4 kaj 310 ĝis 320 mOsm), en kiu glukozo estas 13C6-glukoza anstataŭigo (Eurisotop, katalognumero CLM-1396). Por eksperimentoj kiuj postulas piruvatan markadon, transdonu la akutajn cerbajn tranĉaĵojn al pli alta Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natria fosfata bufro, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukozo, 1.0 mM CaCl2 kaj aldonu 2.0 mM MgCl2, alĝustigu al pH 7.4 kaj 310 ĝis 320 mOsm), kaj aldonu 1 mM 1-[1-13C]piruvaton (Eurisotop, katalognumero CLM-1082). Kovu la sekciojn dum 90 minutoj je 37°C. Ĉe la fino de la eksperimento, la sekcioj estis rapide lavitaj per akva solvaĵo (pH 7.4) enhavanta 75 mM amonian karbonaton, kaj poste homogenigitaj en 40:40:20 (v:v:v) acetonitrilo (ACN): metanolo: akvo. Post kiam la sekcioj estis inkubaciitaj sur glacio dum 30 minutoj, la specimenoj estis centrifugitaj je 21 000 g dum 10 minutoj je 4 °C, kaj la klara supernatanto estis sekigita en SpeedVac-koncentrilo. La rezulta sekigita metabolita buleto estis konservita je -80 °C ĝis analizo.
Analizo per likva kromatografio-masa spektrometrio de 13C-markitaj aminoacidoj. Por analizo per likva kromatografio-masa spektrometrio (LC-MS), la metabolita buleto estis resuspendita en 75 μl da LC-MS-akvo (Honeywell). Post centrifugado je 21 000 g dum 5 minutoj je 4 °C, 20 μl da la klarigita supernatanto estis uzataj por analizo de aminoacida fluo, dum la resto de la ekstrakto estis tuj uzata por anjona analizo (vidu sube). Aminoacida analizo estis farita uzante la antaŭe priskribitan protokolon por derivado de benzoilklorido (55, 56). En la unua paŝo, 10 μl da 100 mM natria karbonato (Sigma-Aldrich) estis aldonita al 20 μl da metabolita ekstrakto, kaj poste 10 μl da 2% benzoilklorido (Sigma-Aldrich) estis aldonita al la LC-grada ACN. La specimeno estis nelonge kirlitegita kaj poste centrifugita je 21 000 g dum 5 minutoj je 20 °C. Transdonu la klarigitan supernatant al 2 ml aŭtomata specimenila fiolo kun konusa vitra enigaĵo (200 μl volumeno). La specimenoj estis analizitaj uzante la Acquity iClass ultra-altan rendimentan LC-sistemon (Waters) konektitan al la Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) alt-rezolucia preciza masspektrometro (Thermo Fisher Scientific). Por analizo, 2 μl de la derivitigita specimeno estis injektitaj en 100×1,0 mm alt-fortan silician T3-kolumnon (Waters) enhavantan 1,8 μm partiklojn. La flukvanto estas 100 μl/min, kaj la bufrosistemo konsistas el bufro A (10 mM amonia formiato kaj 0,15% formika acido en akvo) kaj bufro B (ACN). La gradiento estas jena: 0%B je 0 minutoj; 0%B. 0 ĝis 15% B je 0 ĝis 0,1 minutoj; 15 ĝis 17% B je 0,1 ĝis 0,5 minutoj; B je 17 ĝis 55% je 0,5 ĝis 14 minutoj; B je 55 ĝis 70% je 14 ĝis 14,5 minutoj; je 14,5 ĝis 70 ĝis 100% B je 18 minutoj; 100% B je 18 ĝis 19 minutoj; 100 ĝis 0% B je 19 ĝis 19,1 minutoj; 0% B je 19,1 ĝis 28 minutoj (55, 56). La QE-HF masspektrometro funkcias en pozitiva joniga reĝimo kun masa gamo de m/z (maso/ŝarga proporcio) de 50 ĝis 750. La aplikata rezolucio estas 60 000, kaj la gajno-kontrola (AGC) jona celo estas 3×10⁶, kaj la maksimuma jona tempo estas 100 milisekundoj. La varmigita elektroŝpruca joniga (ESI) fonto funkcias je ŝpruca tensio de 3,5 kV, kapilara temperaturo de 250 °C, inga aerfluo de 60 AU (arbitraj unuoj), kaj helpa aerfluo de 20 AU. 250 °C. La S-lenso estas agordita je 60 AU.
Analizo per anjona kromatografio-MS de organikaj acidoj markitaj per 13C. La restanta metabolita precipitaĵo (55 μl) estis analizita uzante Dionex-jonan kromatografian sistemon (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) konektitan al QE-HF-masspektrometro (Thermo Fisher Scientific). Mallonge, 5 μl da metabolita ekstrakto estis injektitaj en Dionex IonPac AS11-HC-kolumnon ekipitan per HPLC (2 mm × 250 mm, partikla grandeco 4 μm, Thermo Fisher Scientific) en puŝ-ena parta bukla reĝimo kun pleniga proporcio de 1.) Dionex IonPac AG11-HC-gardkolumnon (2 mm × 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). La kolumna temperaturo estas konservata je 30 °C, kaj la aŭtomata specimenigilo estas agordita je 6 °C. Uzu kalian hidroksidan kartoĉon provizitan per dejonigita akvo por generi kalian hidroksidan gradienton tra la eluanta generatoro. Apartigo de metabolitoj je flukvanto de 380 μl/min, aplikante la jenan gradienton: 0 ĝis 3 minutoj, 10 mM KOH; 3 ĝis 12 minutoj, 10 ĝis 50 mM KOH; 12 ĝis 19 minutoj, 50 ĝis 100 mM KOH; 19 ĝis 21 minutoj, 100 mM KOH; 21 ĝis 21,5 minutoj, 100 ĝis 10 mM KOH. La kolono estis reekvilibrita sub 10 mM KOH dum 8,5 minutoj.
La eluitaj metabolitoj estas kombinitaj kun fluo de izopropanolo je 150 μl/min post la kolono kaj poste direktitaj al alt-rezolucia masspektrometro funkcianta en negativa joniga reĝimo. MS monitoras la masintervalon de m/z 50 ĝis 750 kun rezolucio de 60 000. La AGC estas agordita al 1×10⁶, kaj la maksimuma jontempo estas tenata je 100 ms. La varmigita ESI-fonto funkciis je ŝpruca tensio de 3,5 kV. La aliaj agordoj de la jonfonto estas jenaj: kapilara temperaturo 275 °C; ingogasa fluo, 60 AU; helpgasa fluo, 20 AU je 300 °C, kaj S-lensa agordo al 60 AU.
Datuma analizo de 13C-markitaj metabolitoj. Uzu la programaron TraceFinder (versio 4.2, Thermo Fisher Scientific) por datuma analizo de la izotopa proporcio. La identeco de ĉiu kombinaĵo estis kontrolita per fidinda referenca kombinaĵo kaj sendepende analizita. Por plenumi izotopan riĉigan analizon, la areo de la ekstraktita jona kromatogramo (XIC) de ĉiu 13C-izotopo (Mn) estis ekstraktita el [M + H] +, kie n estas la karbona nombro de la cela kombinaĵo, uzata por analizi aminoacidojn aŭ [MH] + estas uzata por analizi anjonojn. La masa precizeco de XIC estas malpli ol kvin partoj por miliono, kaj la precizeco de RT estas 0.05 minutoj. La riĉiga analizo estas plenumita kalkulante la proporcion de ĉiu detektita izotopo al la sumo de ĉiuj izotopoj de la koresponda kombinaĵo. Ĉi tiuj proporcioj estas donitaj kiel procentaj valoroj por ĉiu izotopo, kaj la rezultoj estas esprimitaj kiel molara procenta riĉigo (MPE), kiel antaŭe priskribite (42).
La frostigita neŭrona buleto estis homogenigita en glacie malvarma 80% metanolo (v/v), kirlite, kaj inkubita je -20°C dum 30 minutoj. Denove kirlite la specimenon kaj kirlu je +4°C dum 30 minutoj. La specimeno estis centrifugita je 21 000 g dum 5 minutoj je 4°C, kaj poste la rezulta supernatanto estis kolektita kaj sekigita uzante SpeedVac-koncentrilon je 25°C por posta analizo. Kiel priskribite supre, LC-MS-analizo estis farita sur la aminoacidoj de la ordigitaj ĉeloj. Uzante TraceFinder (versio 4.2, Thermo Fisher Scientific), datumanalizo estis farita uzante la monoizotopan mason de ĉiu kombinaĵo. Kvantila normaligo de metabolitaj datumoj estis farita uzante la programarpakaĵon preprocessCore (57).
Preparado de tranĉaĵoj. La muso estis rapide narkotita per karbondioksido kaj senkapigita, la cerbo estis rapide forigita de la kranio, kaj la glaciplena vibra tranĉilo (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germanio) estis uzata por tranĉi ĝin en sagitajn sekciojn de 300 ĝis 375 μm. Malvarma karbongasigado (95% O2 kaj 5% CO2). Malalta Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natria fosfata bufro, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukozo, 1.0 mM CaCl2 kaj 6.0 mM MgCl2. Alĝustigu al pH 7.4 kaj 310 ĝis 330 mOsm). Transdonu la akiritajn cerbajn tranĉaĵojn al ĉambro enhavanta pli altan Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natria fosfata bufro, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukozo, 4.0 mM CaCl2 kaj mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 kaj 310 ĝis 320 mOsm). Konservu la tranĉaĵojn dum 20 ĝis 30 minutoj por ke ili povu esti restaŭritaj antaŭ registrado.
registrado. Mikroskopa scenejo ekipita per fiksa registra ĉambro kaj 20x akva mergobjektiva lenso (Scientifica) estis uzata por ĉiuj registradoj. La supozeblaj Purkinje-ĉeloj estis identigitaj per (i) korpograndeco, (ii) anatomia loko de la cerebelo, kaj (iii) esprimo de la fluoreska mtYFP-raportista geno. La peceta pipeto kun pinta rezisto de 5 ĝis 11 megaomoj estas eltirita per borosilikata vitra kapilaro (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Germanio) kaj horizontala pipeto Instruments (P-1000, Sutter), Novato, Kalifornio). Ĉiuj registradoj estis faritaj per ELC-03XS npi-peceta krampa amplifilo (npi electronic GmbH, Tam, Germanio), kiu estis kontrolita per la programaro Signal (versio 6.0, Cambridge Electronic, Kembriĝo, UK). La eksperimento estis registrita je prova frekvenco de 12,5 kHz. La signalo estas filtrita per du mallongpasaj Bessel-filtriloj kun tranĉfrekvencoj de 1,3 kaj 10 kHz respektive. La kapacitanco de la membrano kaj la pipeto estas kompensata per la kompenscirkvito uzante la amplifilon. Ĉiuj eksperimentoj estis faritaj sub la kontrolo de fotilo Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Germanio), kiu estis kontrolita per la programaro Hokawo (versio 2.8, Hamamatsu, Gerden, Germanio).
Rutina agordo kaj analizo de tutaj ĉeloj. Tuj antaŭ registrado, plenigu la pipeton per la interna solvaĵo enhavanta la jenajn substancojn: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM kalia glukonato, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM guanosina trifosfato (GTP) (Na) kaj 10.0 mM kreatinina fosfato estis ĝustigitaj al pH 7.25, kaj la osmoza premo estis 290 mOsm (sakarozo). Tuj post apliko de forto de 0 pA por rompi la membranon, la ripoza membrana potencialo estis mezurita. La enira rezisto estas mezurita per apliko de hiperpolarigitaj kurentoj de -40, -30, -20 kaj -10 pA. Mezuru la magnitudon de la tensiorespondo kaj uzu la leĝon de Omo por kalkuli la eniran reziston. Spontanea aktiveco estis registrita per tensiomezurilo dum 5 minutoj, kaj sPSC estis identigita kaj mezurita per Igor Pro (versio 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregono, Usono) uzante duonaŭtomatan rekonan skripton. La IV-kurbo kaj ekvilibrofluo estas mezuritaj per streĉado de la baterio je malsamaj potencialoj (komencante de -110 mV) kaj pliigante la tension en 5 mV paŝoj. La produktado de AP estis testita per apliko de malpolariga kurento. Fiksu la ĉelon je -70 mV dum apliko de malpolariga kurenta pulso. Adaptu la paŝograndecon de ĉiu registra unuo aparte (10 ĝis 60 pA). Kalkulu la maksimuman AP-frekvencon permane kalkulante la pulsajn pikilojn, kiuj kaŭzas la plej altan AP-frekvencon. La AP-sojlo estas analizita per uzado de la dua derivaĵo de la malpolariga pulso, kiu unue ekigas unu aŭ plurajn AP-ojn.
Agordo kaj analizo de truita peceto. Faru la registradon de la truita peceto uzante normajn protokolojn. Uzu pipeton sen ATP kaj GTP, kiu ne enhavas la jenajn ingrediencojn: 128 mM glukonato K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA kaj 2 mM MgCl2, kaj alĝustigu ĝin al pH 7.2 (uzante KOH). ATP kaj GTP estas preterlasitaj el la intraĉela solvaĵo por malhelpi nekontrolitan permeablon de la ĉelmembrano. La peceta pipeto estas plenigita per amfotericin-entenanta interna solvaĵo (proksimume 200 ĝis 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) por akiri truitan pecetan registron. Amfotericino estis dissolvita en dimetilsulfoksido (fina koncentriĝo: 0.1 ĝis 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). La uzita koncentriĝo de DMSO ne havis signifan efikon sur la studitajn neŭronojn. Dum la truprocezo, la kanala rezistanco (Ra) estis kontinue monitorata, kaj la eksperimento komenciĝis post kiam la amplitudo de Ra kaj AP stabiliĝis (20-40 minutoj). Spontanea aktiveco estas mezurata en tensio- kaj/aŭ kurentkrampo dum 2 ĝis 5 minutoj. Datumanalizo estis farita uzante Igor Pro (versio 7.05.2, WaveMetrics, Usono), Excel (versio 2010, Microsoft Corporation, Redmond, Usono) kaj GraphPad Prism (versio 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, Kalifornio (Usono). Por identigi spontaneajn AP-ojn, la kromprogramo NeuroMatic v3.0c de IgorPro estas uzata. Aŭtomate identigu AP-ojn uzante difinitan sojlon, kiu estas individue alĝustigita por ĉiu registro. Uzante la pikilintervalon, determinu la pikilfrekvencon kun la maksimuma tuja pikilfrekvenco kaj la meza pikilfrekvenco.
PN-izoligado. Adaptiĝante al la antaŭe publikigita protokolo, PN-oj estis purigitaj el la musa cerebelo je specifa stadio (58). Mallonge, la cerebelo estis dissekcita kaj hakita en glacie malvarma disociiga medio [sen HBSS Ca2+ kaj Mg2+, suplementita per 20 mM glukozo, penicilino (50 U/ml) kaj streptomicino (0.05 mg/ml)], kaj poste digestita la medio en papaino [HBSS, suplementita per 1-cisteino·HCl (1 mg/ml), papaino (16 U/ml) kaj deoksiribonukleazo I (DNase I; 0.1 mg/ml)]. Traktu dum 30 minutoj je 30°C. Unue lavu la histojn en HBSS-medio enhavanta ovmukon (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) kaj DNazon (0.1 mg/ml) je ĉambra temperaturo por malhelpi enziman digestadon, kaj poste en la HBSS-medio enhavanta 20 mM glukozon. Milde muelante en HBSS, penicilino (50 U/ml), streptomicino (0.05 mg/ml) kaj DNazo (0.1 mg/ml) liberigas unuopajn ĉelojn. La rezulta ĉelsuspendo estis filtrita tra 70μm ĉelkribrilo, poste la ĉeloj estis peletigitaj per centrifugado (1110 rpm, 5 minutoj, 4°C) kaj resuspenditaj en ordiga medio [HBSS, suplementita per 20 mM glukozo, 20% feta bova serumo, penicilino (50 U/ml) kaj streptomicino (0.05 mg/ml)]; taksu ĉelviveblecon per propidiuma jodido kaj alĝustigu la ĉeldensecon al 1×10⁶ ĝis 2×10⁶ ĉeloj/ml. Antaŭ fluocitometrio, la suspendo estis filtrita tra 50 μm ĉelkribrilo.
Fluocitometro. Ĉelsortigo estis farita je 4°C uzante FACSAria III-maŝinon (BD Biosciences) kaj FACSDiva-programaron (BD Biosciences, versio 8.0.1). La ĉelsuspendo estis ordigita uzante 100-μm-ajuton sub premo de 20 psi je rapideco de ~2800 eventoj/sek. Ĉar tradiciaj kriterioj pri enigo (ĉelgrandeco, bimodala diskriminacio kaj disĵetaj karakterizaĵoj) ne povas certigi la ĝustan izoladon de PN de aliaj ĉeltipoj, la strategio pri enigo estas difinita surbaze de rekta komparo de la YFP-intenseco kaj aŭtofluoreskeco en mitoYFP+ ​​kaj la kontrolaj mitoYFP-musoj. YFP estas ekscitita per surradiado de la specimeno per 488 nm lasera linio, kaj la signalo estas detektita uzante 530/30 nm bendpasan filtrilon. En mitoYFP+ ​​musoj, la relativa forto de la raportista geno Rosa26-mitoYFP ankaŭ estas uzata por distingi neŭronajn korpajn kaj aksonajn fragmentojn. 7-AAD estas ekscitita per 561 nm flava lasero kaj detektita per 675/20 nm bendpasa filtrilo por ekskludi mortajn ĉelojn. Por samtempe apartigi astrocitojn, la ĉelsuspendo estis kolorita per ACSA-2-APC, poste la specimeno estis surradiita per 640 nm laserlinio, kaj 660/20 nm bendpasa filtrilo estis uzata por detekti la signalon.
La kolektitaj ĉeloj estis peletigitaj per centrifugado (1110 rpm, 5 minutoj, 4°C) kaj konservitaj je -80°C ĝis uzo. Mfn2cKO-musoj kaj iliaj idoj estas klasifikitaj en la sama tago por minimumigi proceduran ŝanĝiĝemon. Prezentado kaj analizo de FACS-datumoj estis faritaj uzante la programaron FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregono, Usono).
Kiel menciite supre (59), realtempa PCR estas uzata por izoli DNA-on el la ordigitaj neŭronoj por posta mtDNA-kvantigo. La lineareco kaj sojla sentiveco estis komence testitaj per qPCR sur malsamaj nombroj da ĉeloj. Mallonge, kolekti 300 PN en liza bufro konsistanta el 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 kaj proteinazo K (200 ng/ml) kaj kovi je 55°C dum 120 minutoj. La ĉeloj estis plue kovitaj je 95°C dum 10 minutoj por certigi kompletan malaktivigon de proteinazo K. Uzante TaqMan-sondilon (Thermo Fisher) specifan por mt-Nd1, mtDNA estis mezurita per duonkvanta PCR en la 7900HT Real-Time PCR-sistemo (Thermo Fisher Scientific). Science, katalognumero Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, katalognumero AIVI3E8) kaj 18S (Thermo Fisher Scientific, katalognumero Hs99999901_s1) genoj.
Preparado de proteoma specimeno. Per varmigo de la solvaĵo je 95°C dum 10 minutoj kaj sonikado, en la liza bufro [6 M guanidina klorido, 10 mM tris(2-karboksietila)fosfina klorido, 10 mM kloroacetamido kaj 100 mM tris-Lize frostigitaj neŭronaj buletoj en HCl]. Sur Bioruptor (Diagenode) dum 10 minutoj (30 sekundoj da pulso / 30 sekundoj da paŭzo). La specimeno estis diluita 1:10 en 20 mM tris-HCl (pH 8.0), miksita kun 300 ng da tripsina oro (Promega), kaj inkubita dumnokte je 37°C por atingi kompletan digestadon. En la dua tago, la specimeno estis centrifugita je 20,000 g dum 20 minutoj. La supernatanto estis diluita kun 0.1% formika acido, kaj la solvaĵo estis sensaligita per memfaritaj StageTips. La specimeno estis sekigita en SpeedVac-instrumento (Eppendorf-koncentrilo plus 5305) je 45°C, kaj poste la peptido estis suspendita en 0.1% formika acido. Ĉiuj specimenoj estis preparitaj samtempe de la sama persono. Por analizi astrocitajn specimenojn, 4 μg da sensaligitaj peptidoj estis etikeditaj per tandema masa etikedo (TMT10plex, katalognumero 90110, Thermo Fisher Scientific) kun proporcio de peptido al TMT-reakciaĵo de 1:20. Por TMT-etikedado, 0.8 mg da TMT-reakciaĵo estis resuspenditaj en 70 μl da anhidra ACN, kaj la sekigita peptido estis rekonstruita en 9 μl da 0.1 M TEAB (trietilamonia bikarbonato), al kiu 7 μl da TMT-reakciaĵo en ACN estis aldonitaj. La koncentriĝo estis 43.75%. Post 60 minutoj da inkubacio, la reakcio estis estingita per 2 μl da 5% hidroksilamino. La etikeditaj peptidoj estis kolektitaj, sekigitaj, resuspenditaj en 200 μl da 0.1% formika acido (FA), dividitaj en du, kaj poste sensaligitaj uzante memfaritajn StageTips. Uzante UltiMate 3000 ultra alt-efikecan likvan kromatografon (UltiMate 3000 ultra alt-efikecan likvan kromatografon), unu el la du duonoj estis frakciigita sur 1mm x 150mm Acquity-kromatografia kolono plenigita per 130 Å1.7 μm C18-partikloj (Waters, kataloga N-ro SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Apartigu peptidojn je flukvanto de 30 μl/min, apartigu de 1% ĝis 50% bufro B dum 85 minutoj kun paŝopoŝta gradiento de 96 minutoj, de 50% ĝis 95% bufro B dum 3 minutoj, poste 8 minutoj por 95% bufro B; Bufro A estas 5% ACN kaj 10 mM amonia bikarbonato (ABC), kaj bufro B estas 80% ACN kaj 10 mM ABC. Kolektu frakciojn ĉiujn 3 minutojn kaj kombinu ilin en du grupojn (1 + 17, 2 + 18, ktp.) kaj sekigu ilin en vakua centrifugilo.
LC-MS/MS-analizo. Por mas-spektrometrio, la peptidoj (numero r119.aq) estis apartigitaj sur 25 cm, 75 μm interna diametro PicoFrit-analiza kolono (nova objektiva lenso, partnumero PF7508250) ekipita per 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ-medio (Dr. Maisch, mat). Uzu EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Germanio). La kolono estis konservita je 50 °C. Bufroj A kaj B estas 0.1% formika acido en akvo kaj 0.1% formika acido en 80% ACN, respektive. Peptidoj estis apartigitaj de 6% ĝis 31% bufro B dum 65 minutoj kaj de 31% ĝis 50% bufro B dum 5 minutoj kun gradiento de 200 nl/min. La eluitaj peptidoj estis analizitaj per Orbitrap Fusion-mas-spektrometro (Thermo Fisher Scientific). La m/z-mezurado de la peptida antaŭulo estas farata kun rezolucio de 120 000 en la intervalo de 350 ĝis 1500 m/z. Uzante 27% normaligitan kolizian energion, la plej forta antaŭulo kun ŝarga stato de 2 ĝis 6 estas elektita por alt-energia C-kaptila disociiĝo (HCD) per disigo. La ciklotempo estas agordita al 1 s. La m/z-valoro de la peptida fragmento estis mezurita en la jonkaptilo uzante la plej malgrandan AGC-celon de 5×10⁴ kaj la maksimuman injektotempon de 86 ms. Post fragmentiĝo, la antaŭulo estis metita sur la dinamikan ekskludliston dum 45 s. TMT-markitaj peptidoj estis apartigitaj sur 50 cm⁻¹, 75 μm Acclaim PepMap-kolumno (Thermo Fisher Scientific, katalognumero 164942), kaj la migradaj spektroj estis analizitaj sur Orbitrap Lumos Tribrid-masspektrometro (Thermo Fisher Scientific) ekipita per alt-kampa nesimetria ondforma jona (FAIMS) ekipaĵo (Thermo Fisher Scientific) funkcianta je du kompensaj tensioj de −50 kaj −70 V. MS3 elektita surbaze de la sinkroniga antaŭulo estas uzata por mezurado de TMT-raporta jona signalo. La peptida apartigo estis efektivigita sur EASY-nLC 1200, uzante 90% linearan gradientan eluadon, kun bufrokoncentriĝo de 6% ĝis 31%; bufro A estis 0.1% FA, kaj bufro B estis 0.1% FA kaj 80% ACN. La analiza kolono estas funkciigita je 50°C. Uzu FreeStyle (versio 1.6, Thermo Fisher Scientific) por dividi la originalan dosieron laŭ la FAIMS-kompensa tensio.
Proteina identigo kaj kvantigo. Uzante la integritan serĉilon Andromeda, la originalaj datumoj estis analizitaj per MaxQuant versio 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Aldone al la Cre-rekombinazo kaj YFP-sekvencoj akiritaj de Aequorea victoria, peptidfragmentaj spektroj estis serĉitaj por la kanonika sekvenco kaj izoforma sekvenco de la musa referenca proteomo (Proteoma ID UP000000589, elŝutita de UniProt en majo 2017). Metionina oksidado kaj proteina N-fina acetiligo estis agorditaj kiel variaj modifoj; cisteina karbamoila metiligo estis agordita kiel fiksaj modifoj. La digestaj parametroj estas agorditaj al "specifeco" kaj "tripsino/P". La minimuma nombro de peptidoj kaj razilpeptidoj uzataj por proteina identigo estas 1; la minimuma nombro de unikaj peptidoj estas 0. Sub la kondiĉoj de peptida map-kongruigo, la proteina identiga indico estis 0.01. La opcio "Dua Peptido" estas ebligita. Uzu la opcion "kongruo inter kuroj" por transdoni sukcesajn identigojn inter malsamaj originalaj dosieroj. Uzu LFQ-minimuman kvantumon de 1 por senmarka kvantigo (LFQ) (60). La LFQ-intenseco estas filtrita por almenaŭ du validaj valoroj en almenaŭ unu genotipa grupo ĉe ĉiu tempopunkto, kaj estas ekstrapolita de normala distribuo kun larĝo de 0,0,3 kaj malsupreniro de 1,8. Uzu la komputilan platformon Perseus (https://maxquant.net/perseus/) kaj R (https://r-project.org/) por analizi la LFQ-rezultojn. Dudirekta modera t-testo de la programaro limma estis uzata por diferenciga esprima analizo (61). Esplora datumanalizo estas farita uzante ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally kaj pheatmap. La TMT-bazitaj proteomikaj datumoj estis analizitaj uzante MaxQuant-version 1.6.10.43. Serĉu krudajn proteomikajn datumojn el la homa proteomika datumbazo de UniProt, kiu estis elŝutita en septembro 2018. La analizo inkluzivas la izotopan purecan korektan faktoron provizitan de la fabrikanto. Uzu limma en R por diferenciga esprima analizo. La originalaj datumoj, datumbazaj serĉrezultoj, kaj datumanaliza laborfluo kaj rezultoj estas ĉiuj konservitaj en la ProteomeXchange-alianco per la PRIDE-partnera deponejo kun la datumar-identigilo PXD019690.
Funkciaj komentoj riĉigas la analizon. La ilo Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) estis uzata por determini la riĉecon de la funkciaj komentaj terminoj de la datuma aro je 8 semajnoj (Figuro 1). Mallonge, la kvanta proteina listo akirita per LC-MS/MS (tandema masospektrometrio) datuma analizo estas uzata kun la jenaj filtrilaj kriterioj: Mus musculus estas elektita kiel la specio kaj fono, kaj la kategorio montras, ke la P-valoro adaptita de Benjamini por riĉigo 0.05 aŭ malpli estas konsiderata signifa. Por ĉi tiu grafikaĵo, la kvin supraj troaj kategorioj en ĉiu areto bazitaj sur la adaptita P-valoro estas montritaj. Uzante multoblan t-teston, uzante la du-ŝtupan linearan akcelprogramon de Benjamini, Krieger kaj Yekutieli (Q = 5%), temp-kursa proteina esprimo-analizo estas farita sur la gravaj kandidatoj identigitaj en ĉiu kategorio, kaj ĉiu vico estas analizita aparte. Ne necesas adopti koheran norman devio.
Por kompari la rezultojn de ĉi tiu studo kun publikigitaj datumbazoj kaj generi Venn-diagramon en Figuro 1, ni kombinis la kvantan proteinliston kun MitoCarta 2.0-komentoj (24). Uzu la retan ilon "Desegnu Venn-diagramon" (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) por generi la diagramon.
Por detalaj informoj pri la statistikaj proceduroj uzataj por proteomika analizo, bonvolu rilati al la koncerna sekcio de Materialoj kaj Metodoj. Por ĉiuj aliaj eksperimentoj, detalaj informoj troveblas en la koncerna legendo. Krom se alie specifite, ĉiuj datumoj estas esprimitaj kiel meznombro ± SEM, kaj ĉiuj statistikaj analizoj estis faritaj per la programaro GraphPad Prism 8.1.2.
Por suplementaj materialoj por ĉi tiu artikolo, bonvolu vidi http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Ĉi tiu estas artikolo kun libera aliro, distribuita laŭ la kondiĉoj de la permesilo Krea Komunaĵo Atribuite-Nekomerce, kiu permesas la uzon, distribuon kaj reproduktadon en iu ajn medio, kondiĉe ke la fina uzo ne estas por komerca profito kaj la premiso estas, ke la originala verko estas ĝusta. Referenco.
Noto: Ni nur petas vin provizi vian retpoŝtadreson por ke la persono, kiun vi rekomendas al la paĝo, sciu, ke vi volas, ke ili vidu la retpoŝton kaj ke ĝi ne estas spamo. Ni ne kaptos iujn ajn retpoŝtadresojn.
Ĉi tiu demando estas uzata por testi ĉu vi estas vizitanto kaj malhelpi aŭtomatan spam-sendon.
De E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomika analizo de malfunkciaj neŭronoj rivelis, ke metabolaj programoj estas aktivigitaj por kontraŭagi neŭrodegeneradon.
De E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomika analizo de malfunkciaj neŭronoj rivelis, ke metabolaj programoj estas aktivigitaj por kontraŭagi neŭrodegeneradon.
©2020 Amerika Asocio por la Akcelo de Scienco. ĉiuj rajtoj rezervitaj. AAAS estas partnero de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef kaj COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.