Dankon pro via vizito al Nature.com. La versio de retumilo, kiun vi uzas, havas limigitan subtenon por CSS. Por plej bonaj rezultoj, ni rekomendas, ke vi uzu pli novan version de via retumilo (aŭ malŝaltu la Kongruecan Reĝimon en Internet Explorer). Dume, por certigi daŭran subtenon, ni montras la retejon sen stiloj aŭ JavaScript.
Propiona acido (PPA) estas uzata por studi la rolon de mitokondria misfunkcio en neŭrodisvolviĝaj malsanoj kiel ekzemple aŭtisma spektro-malsano. PPA estas konata pro interrompo de mitokondria biogenezo, metabolo kaj ŝanĝiĝo. Tamen, la efikoj de PPA sur mitokondria dinamiko, fisio kaj fuzio restas problemaj pro la kompleksa tempa naturo de ĉi tiuj mekanismoj. Ĉi tie, ni uzas komplementajn kvantajn bildigajn teknikojn por esplori kiel PPA influas mitokondrian ultrastrukturon, morfologion kaj dinamikon en neŭron-similaj SH-SY5Y-ĉeloj. PPA (5 mM) kaŭzis signifan malpliiĝon en mitokondria areo (p < 0.01), Feret-diametro kaj cirkonferenco (p < 0.05), kaj areo 2 (p < 0.01). Analizo per mitokondria okazaĵa lokilo montris signifan pliiĝon (p < 0.05) en fisio- kaj fuzio-okazaĵoj, tiel konservante la integrecon de la mitokondria reto sub stresaj kondiĉoj. Krome, la mRNA-esprimo de cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) kaj OPA1 (p < 0,05) estis signife reduktita. 01). Ĉi tio ilustras la restrukturadon de mitokondria morfologio, biogenezo kaj dinamiko por konservi funkcion sub stresaj kondiĉoj. Niaj datumoj provizas novajn komprenojn pri la efikoj de PPA sur mitokondria dinamiko kaj elstarigas la utilecon de bildigaj teknikoj por studi la kompleksajn reguligajn mekanismojn implikitajn en mitokondriaj stresaj respondoj.
Mitokondrioj estas integritaj partoprenantoj en diversaj ĉelaj funkcioj preter siaj tipaj roloj en energiproduktado kaj biosintezo. Mitokondria metabolo estas ŝlosila reguliganto de kalcia signalado, metabola kaj redoksa homeostazo, inflama signalado, epigenetikaj modifoj, ĉelmultobliĝo, diferenciĝo kaj programita ĉelmorto1. Aparte, mitokondria metabolo estas kritika por neŭrona disvolviĝo, supervivo kaj funkcio kaj estas vaste implikita en diversaj manifestiĝoj de neŭropatologio2,3,4.
Dum la pasinta jardeko, metabola stato aperis kiel centra regulilo de neŭrogenezo, diferenciĝo, maturiĝo kaj plastikeco5,6. Lastatempe, mitokondria morfologio kaj dinamiko fariĝis aparte gravaj komponantoj de mitozo, dinamika procezo kiu konservas aron da sanaj mitokondrioj ene de ĉeloj. Mitokondria dinamiko estas reguligita per kompleksaj interdependaj vojoj intervalantaj de mitokondria biogenezo kaj bioenergetiko ĝis mitokondria fisio, fuzio, transporto kaj forigo7,8. Interrompo de iu ajn el ĉi tiuj integraj mekanismoj difektas la konservadon de sanaj mitokondriaj retoj kaj havas profundajn funkciajn sekvojn por neŭrodisvolviĝo9,10. Efektive, misreguligo de mitokondria dinamiko estas observata en multaj psikiatriaj, neŭrodegeneraj kaj neŭrodisvolviĝaj malsanoj, inkluzive de aŭtismaj spektromalsanoj (ASM)11,12.
Aŭtisma Spektro-Malordo (ASM) estas heterogena neŭrodisvolviĝa malsano kun kompleksa genetika kaj epigenetika arkitekturo. La heredeco de ASM estas nediskutebla, sed la subesta molekula etiologio restas malbone komprenata. Akumuliĝantaj datumoj el antaŭklinikaj modeloj, klinikaj studoj kaj mult-omikaj molekulaj datumaroj provizas kreskantajn pruvojn pri mitokondria misfunkcio en ASM13,14. Ni antaŭe plenumis tutgenoman DNA-metiligan ekzamenon en kohorto de pacientoj kun ASM kaj identigis diferencige metiligitajn genojn grupigitajn laŭ mitokondriaj metabolaj vojoj15. Ni poste raportis diferencigan metiligon de centraj reguligantoj de mitokondria biogenezo kaj dinamiko, kiu estis asociita kun pliigita mtDNA-kopionombro kaj ŝanĝita urina metabola profilo en ASM16. Niaj datumoj provizas kreskantajn pruvojn, ke mitokondria dinamiko kaj homeostazo ludas centran rolon en la patofiziologio de ASM. Tial, plibonigi la mekanisman komprenon pri la rilato inter mitokondria dinamiko, morfologio kaj funkcio estas ŝlosila celo de daŭranta esplorado pri neŭrologiaj malsanoj karakterizitaj per sekundara mitokondria misfunkcio.
Molekulaj teknikoj ofte estas uzataj por studi la rolon de specifaj genoj en mitokondriaj stresrespondoj. Tamen, ĉi tiu aliro povas esti limigita de la multfaceta kaj tempa naturo de mitozaj kontrolmekanismoj. Krome, diferenciga esprimo de mitokondriaj genoj estas nerekta indikilo de funkciaj ŝanĝoj, precipe ĉar nur limigita nombro da genoj estas tipe analizitaj. Tial, pli rektaj metodoj por studi mitokondrian funkcion kaj bioenergetikon estis proponitaj17. Mitokondria morfologio estas proksime rilata al mitokondria dinamiko. Mitokondria formo, konektebleco kaj strukturo estas kritikaj por energiproduktado kaj mitokondria kaj ĉela supervivo5,18. Krome, la diversaj komponantoj de mitozo fokusiĝas al ŝanĝoj en mitokondria morfologio, kiuj povas servi kiel utilaj finpunktoj de mitokondria misfunkcio kaj provizi bazon por postaj mekanismaj studoj.
Mitokondria morfologio povas esti rekte observita per transmisia elektrona mikroskopio (TEM), permesante detalan studon de ĉela ultrastrukturo. TEM rekte bildigas la morfologion, formon kaj strukturon de mitokondriaj krestetoj ĉe la distingivo de individuaj mitokondrioj, anstataŭ fidi nur je gena transskribo, proteina esprimo aŭ mitokondriaj funkciaj parametroj en ĉelaj populacioj17,19,20. Krome, TEM faciligas la studon de interagoj inter mitokondrioj kaj aliaj organetoj, kiel ekzemple la endoplasma retikulo kaj aŭtofagosomoj, kiuj ludas ŝlosilajn rolojn en mitokondria funkcio kaj homeostazo21,22. Tiel, tio faras TEM bonan deirpunkton por studi mitokondrian misfunkcion antaŭ ol fokusiĝi sur specifaj vojoj aŭ genoj. Ĉar mitokondria funkcio fariĝas ĉiam pli grava por neŭropatologio, ekzistas klara bezono povi rekte kaj kvante studi mitokondrian morfologion kaj dinamikon en in vitro neuronalaj modeloj.
En ĉi tiu artikolo, ni ekzamenas mitokondrian dinamikon en neŭrona modelo de mitokondria misfunkcio en aŭtisma spektro-malsano. Ni antaŭe raportis diferencigan metiligon de propionil-CoA-karboksilazo beta (PCCB) en ASD15, subunuo de la mitokondria propionil-CoA-karboksilaza enzimo PCC. Misregulado de PCC estas konata kaŭzi toksan amasiĝon de propionilaj derivaĵoj, inkluzive de propionata acido (PPA)23,24,25. PPA montriĝis interrompi neŭronan metabolon kaj ŝanĝi konduton in vivo kaj estas establita besta modelo por studi neŭrodisvolviĝajn mekanismojn implikitajn en ASD26,27,28. Plie, PPA laŭ raportoj interrompas mitokondrian membranpotencialon, biogenezon kaj spiradon in vitro kaj estis vaste uzata por modeli mitokondrian misfunkcion en neŭronoj29,30. Tamen, la efiko de PPA-induktita mitokondria misfunkcio sur mitokondria morfologio kaj dinamiko restas malbone komprenata.
Ĉi tiu studo uzas komplementajn bildigajn teknikojn por kvantigi la efikojn de PPA sur mitokondrian morfologion, dinamikon kaj funkcion en SH-SY5Y-ĉeloj. Unue, ni evoluigis TEM-metodon por bildigi ŝanĝojn en mitokondria morfologio kaj ultrastrukturo17,31,32. Konsiderante la dinamikan naturon de mitokondrioj33, ni ankaŭ uzis analizon de mitokondria okazaĵlokigilo (MEL) por kvantigi ŝanĝojn en la ekvilibro inter fisio- kaj fuzio-okazaĵoj, mitokondria nombro kaj volumeno sub PPA-streso. Fine, ni ekzamenis ĉu mitokondria morfologio kaj dinamiko estas asociitaj kun ŝanĝoj en la esprimo de genoj implikitaj en biogenezo, fisio kaj fuzio. Kune, niaj datumoj ilustras la defion klarigi la kompleksecon de la mekanismoj reguligantaj mitokondrian dinamikon. Ni elstarigas la utilecon de TEM en studado de mitokondria morfologio kiel mezurebla konverĝa finpunkto de mitozo en SH-SY5Y-ĉeloj. Plie, ni elstarigas, ke TEM-datumoj provizas la plej riĉajn informojn kiam kombinite kun bildigaj teknikoj, kiuj ankaŭ kaptas dinamikajn eventojn en respondo al metabola streso. Plia karakterizado de la molekulaj reguligaj mekanismoj, kiuj subtenas neuronal ĉelmitozon, povus provizi gravajn komprenojn pri la mitokondria komponento de nerva sistemo kaj neŭrodegeneraj malsanoj.
Por indukti mitokondrian streson, SH-SY5Y-ĉeloj estis traktitaj per PPA uzante 3 mM kaj 5 mM natrian propionaton (NaP). Antaŭ TEM, la specimenoj estis submetitaj al kriogena specimenpreparado uzante altpreman frostigon kaj frostigon (Fig. 1a). Ni evoluigis aŭtomatigitan mitokondrian bildan analizan sistemon por mezuri ok morfologiajn parametrojn de mitokondriaj populacioj trans tri biologiaj ripetoj. Ni trovis, ke PPA-traktado signife ŝanĝis kvar parametrojn: areon 2, areon, perimetron kaj Feret-diametron (Fig. 1b-e). Areo 2 malpliiĝis signife kun kaj 3 mM kaj 5 mM PPA-traktado (p = 0,0183 kaj p = 0,002, respektive) (Fig. 1b), dum areo (p = 0,003), perimetro (p = 0,0106) kaj Feret-diametro ĉiuj malpliiĝis signife. Estis signifa redukto (p = 0,0172) en la 5 mM-traktadgrupo kompare kun la kontrolgrupo (Fig. 1c-e). Signifaj reduktoj en areo kaj cirkonferenco montris, ke ĉeloj traktitaj per 5 mM PPA havis pli malgrandajn, pli rondajn mitokondriojn, kaj ke ĉi tiuj mitokondrioj estis malpli longformaj ol tiuj en kontrolĉeloj. Ĉi tio ankaŭ kongruas kun signifa malpliiĝo en la Feret-diametro, sendependa parametro indikanta malpliiĝon en la plej granda distanco inter partiklaj randoj. Ŝanĝoj en la ultrastrukturo de la krustetoj estis observitaj: la krustetoj fariĝis malpli okulfrapaj sub la influo de PPA-streso (Fig. 1a, panelo B). Tamen, ne ĉiuj bildoj klare reflektis la ultrastrukturon de la krustetoj, do kvanta analizo de ĉi tiuj ŝanĝoj ne estis farita. Ĉi tiuj TEM-datumoj povas reflekti tri eblajn scenarojn: (1) PPA plifortigas fision aŭ inhibicias fuzion, kaŭzante ŝrumpigon de ekzistantaj mitokondrioj; (2) plifortigita biogenezo kreas novajn, pli malgrandajn mitokondriojn aŭ (3) samtempe induktas ambaŭ mekanismojn. Kvankam ĉi tiuj kondiĉoj ne povas esti distingitaj per TEM, signifaj morfologiaj ŝanĝoj indikas ŝanĝojn en mitokondria homeostazo kaj dinamiko sub PPA-streso. Ni poste esploris pliajn parametrojn por plue karakterizi ĉi tiun dinamikon kaj la eblajn mekanismojn subestantajn ilin.
Propiona acido (PPA) remodelas mitokondrian morfologion. (a) Reprezentaj bildoj de transmisia elektrona mikroskopio (TEM) montrantaj, ke mitokondria grandeco malpliiĝas kaj mitokondrioj fariĝas pli malgrandaj kaj pli rondaj kun kreskanta PPA-traktado; 0 mM (netraktita), 3 mM kaj 5 mM, respektive. Ruĝaj sagoj indikas mitokondriojn. (b-e) SH-SY5Y-ĉeloj traktitaj per PPA dum 24 horoj estis preparitaj por TEM kaj la rezultoj estis analizitaj uzante Fiji/ImageJ. Kvar el la ok parametroj montris signifajn diferencojn inter kontrolaj (netraktitaj, 0 mM PPA) kaj traktitaj (3 mM kaj 5 mM PPA) ĉeloj. (b) Regiono 2, (c) Areo, (d) Perimetro, (e) Diametro de Feret. Unudirekta varianco-analizo (kontrolo kontraŭ traktado) kaj la testo de multobla komparo de Dunnett estis uzitaj por determini signifajn diferencojn (p < 0,05). Datenpunktoj reprezentas la mezan mitokondrian valoron por ĉiu individua ĉelo, kaj erarstangoj reprezentas la meznombron ± SEM. La montritaj datumoj reprezentas n = 3, almenaŭ 24 ĉelojn por ripeto; entute 266 bildoj estis analizitaj; * indikas p < 0,05, ** indikas p < 0,01.
Por plue karakterizi kiel mitokondriaj dinamikoj respondas al PPA, ni kolorigis mitokondriojn per tetrametilrodamina etila estero (TMRE) kaj uzis temp-intervalan mikroskopion kaj MEL-analizon por lokalizi kaj kvantigi mitokondriojn post 24 horoj je 3 kaj 5 mM PPA. Traktado de fisio- kaj fuzio-okazaĵoj. (Fig. 2a). Post MEL-analizo, mitokondrioj estis plue analizitaj por kvantigi la nombron de mitokondriaj strukturoj kaj ilian averaĝan volumenon. Ni observis malgrandan sed signifan pliiĝon en la nombro da fisiokazaĵoj okazantaj je 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] kompare kun fisio [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)] kaj fuzio [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] kaj fuzio [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] [0.05)] <0.05)] estis signife pliigitaj je 5 mM kompare kun kontrolo (Fig. 3b). La nombro da mitokondrioj signife pliiĝis je ambaŭ 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] kaj 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (Fig. 3c), dum la averaĝa volumeno de ĉiu mitokondria strukturo restis senŝanĝa (Fig. 3c). 3d). Sume, ĉi tio sugestas, ke restrukturado de mitokondria dinamiko servas kiel kompensa respondo, kiu sukcese konservas la integrecon de la mitokondria reto. La pliiĝo en la nombro de fisiokazaĵoj je 3 mM PPA sugestas, ke la pliiĝo en mitokondria nombro parte ŝuldiĝas al mitokondria fisio, sed ĉar la meza mitokondria volumeno restas esence senŝanĝa, biogenezo ne povas esti ekskludita kiel plia kompensa respondo. Tamen, ĉi tiuj datumoj kongruas kun la pli malgrandaj, rondaj mitokondriaj strukturoj observitaj per TEM kaj ankaŭ montras signifajn ŝanĝojn en mitokondria dinamiko induktita de PPA.
Propiona acido (PPA) induktas dinamikan mitokondrian restrukturadon por konservi retintegrecon. SH-SY5Y-ĉeloj estis kultivitaj, traktitaj per 3 kaj 5 mM PPA dum 24 horoj kaj koloritaj per TMRE kaj Hoechst 33342 sekvata de MEL-analizo. (a) Reprezentaj temp-intervalaj mikroskopiaj bildoj prezentantaj koloron kaj binarigitajn maksimumajn intensecajn projekciojn je tempo 2 (t2) por ĉiu kondiĉo. Elektitaj regionoj indikitaj en ĉiu duuma bildo estas plifortigitaj kaj montrataj en 3D je tri malsamaj tempokadroj (t1-t3) por ilustri la dinamikon laŭlonge de la tempo; fuziaj eventoj estas elstarigitaj per verda koloro; fisio-eventoj estas elstarigitaj per verda koloro. Montritaj per ruĝo. (b) Meza nombro da dinamikaj eventoj por kondiĉo. (c) Meza nombro da mitokondriaj strukturoj por ĉelo. (d) Meza volumeno (µm3) de ĉiu mitokondria strukturo por ĉelo. La montritaj datumoj estas reprezentaj por n = 15 ĉeloj por traktadgrupo. La montritaj erarstangoj reprezentas meznombro ± SEM, skalstango = 10 μm, * p < 0,05.
Propiona acido (PPA) kaŭzas transkripcian subpremadon de genoj asociitaj kun mitokondria dinamiko. SH-SY5Y-ĉeloj estis traktitaj per 3 kaj 5 mM PPA dum 24 horoj. Relativa gena kvantigo estis farita uzante RT-qPCR kaj normaligita al B2M. Mitokondriaj biogenezaj genoj (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 kaj (d) NFE2L2. Mitokondriaj fuziaj kaj fisio-genoj (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 kaj (i) DRP1. Signifaj diferencoj (p < 0.05) estis testitaj uzante unudirektan ANOVA (kontrolo kontraŭ traktado) kaj la multoblan komparan teston de Dunnett: * indikas p < 0.05, ** indikas p < 0.01, kaj **** indikas p < 0.0001. Stangoj reprezentas mezan esprimon ± SEM. La montritaj datumoj reprezentas n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), kaj n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) biologiajn ripetojn.
Datumoj de TEM kaj MEL-analizoj kune indikas, ke PPA ŝanĝas mitokondrian morfologion kaj dinamikon. Tamen, ĉi tiuj bildigaj teknikoj ne donas komprenon pri la subestaj mekanismoj, kiuj pelas ĉi tiujn procezojn. Tial ni ekzamenis la mRNA-esprimon de naŭ ŝlosilaj reguligantoj de mitokondria dinamiko, biogenezo kaj mitozo en respondo al PPA-traktado. Ni kvantigis ĉelan mieloman onkogenon (cMYC), nuklean spiran faktoron (NRF1), mitokondrian transkripcifaktoron 1 (TFAM), NFE2-similan transkripcifaktoron BZIP (NFE2L2), gastrin-similan proteinon 2 (STOML2), optikan nervatrofion 1 (OPA1), Mitofuzinon 1 (MFN1), Mitofuzinon 2 (MFN2) kaj dinamin-rilatan proteinon 1 (DRP1) post 24 horoj da traktado kun 3 mM kaj 5 mM PPA. Ni observis 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 kaj p < 0,0001, respektive) kaj 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) PPA-traktadon. (Fig. 3a–c). La malpliiĝo de mRNA-esprimo estis doz-dependa: la esprimo de cMYC, NRF1 kaj TFAM malpliiĝis je 5,7, 2,6 kaj 1,9 fojojn je 3 mM, respektive, kaj je 11,2, 3 kaj 2,2 fojojn je 5 mM. Kontraste, la centra redoksa biogeneza geno NFE2L2 ne ŝanĝiĝis ĉe iu ajn koncentriĝo de PPA, kvankam simila doz-dependa tendenco de malpliiĝinta esprimo estis observita (Fig. 3d).
Ni ankaŭ ekzamenis la esprimon de klasikaj genoj implikitaj en la reguligo de fisio kaj fuzio. Oni supozas, ke STOML2 partoprenas en fuzio, mitofagio kaj biogenezo, kaj ĝia esprimo estis signife reduktita (p < 0,0001) je 3 mM (2,4-obla ŝanĝo) kaj 5 mM (2,8-obla ŝanĝo) PPA (Fig. 1). 3d). Simile, la esprimo de la fuzia geno de OPA1 malpliiĝis je 3 mM (1,6-obla ŝanĝo) kaj 5 mM (1,9-obla ŝanĝo) PPA (p = 0,006 kaj p = 0,0024, respektive) (Fig. 3f). Tamen, ni ne trovis signifajn diferencojn en la esprimo de la fuziaj genoj MFN1, MFN2 aŭ la fisia geno DRP1 sub 24-hora PPA-streso (Fig. 3g–i). Krome, ni trovis, ke la niveloj de kvar fuziaj kaj fisioproteinoj (OPA1, MFN1, MFN2 kaj DRP1) ne ŝanĝiĝis sub la samaj kondiĉoj (Fig. 4a-d). Gravas noti, ke ĉi tiuj datumoj reflektas ununuran momenton kaj eble ne reflektas ŝanĝojn en proteina esprimo aŭ agadniveloj dum la fruaj stadioj de PPA-streso. Tamen, signifaj reduktoj en la esprimo de cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 kaj OPA1 indikas signifan transkripcian disreguligon de mitokondria metabolo, biogenezo kaj dinamiko. Krome, ĉi tiuj datumoj elstarigas la utilecon de bildigaj teknikoj por rekte studi finstatajn ŝanĝojn en mitokondria funkcio.
La niveloj de fuziaj kaj fisiofaktoroj ne ŝanĝiĝis post traktado per propionata acido (PPA). SH-SY5Y-ĉeloj estis traktitaj per 3 kaj 5 mM PPA dum 24 horoj. La proteinniveloj estis kvantigitaj per okcidenta makulanalizo, kaj la esprimniveloj estis normaligitaj al totala proteino. Meza proteina esprimo kaj reprezentaj okcidentaj makulanalizoj de cela kaj totala proteino estas montritaj. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. La stangoj reprezentas meznombro ± SEM, kaj la montritaj datumoj estas reprezentaj por n = 3 biologiaj ripetoj. Multoblaj komparoj (p < 0,05) estis faritaj uzante unudirektan variancan analizon kaj la teston de Dunnett. La originala ĝelo kaj makulanalizo estas montritaj en Figuro S1.
Mitokondria misfunkcio estas asociita kun multsistemaj malsanoj, kiuj varias de metabolaj, kardiovaskulaj kaj muskolaj malsanoj ĝis neŭrologiaj malsanoj1,10. Multaj neŭrodegeneraj kaj neŭrodegeneraj malsanoj estas asociitaj kun mitokondria misfunkcio, elstarigante la gravecon de ĉi tiuj organetoj dum la tuta vivo de la cerbo. Ĉi tiuj malsanoj inkluzivas Parkinson-malsanon, Alzheimer-malsanon kaj ASD3,4,18. Tamen, aliro al cerba histo por studi ĉi tiujn malsanojn estas malfacila, precipe je la mekanisma nivelo, igante ĉelajn modelsistemojn necesa alternativo. En ĉi tiu studo, ni uzas ĉelan modelsistemon uzantan PPA-traktitajn SH-SY5Y-ĉelojn por resumi la mitokondrian misfunkcion observitan en neŭronaj malsanoj, precipe aŭtismaj spektro-malsanoj. Uzi ĉi tiun PPA-modelon por studi mitokondrian dinamikon en neŭronoj povus provizi komprenon pri la etiologio de ASD.
Ni esploris la eblecon uzi TEM por vidi ŝanĝojn en mitokondria morfologio. Gravas noti, ke TEM devas esti uzata ĝuste por maksimumigi ĝian efikecon. Preparado de kriogenaj specimenoj permesas pli bonan konservadon de neŭronaj strukturoj samtempe fiksante ĉelajn komponantojn kaj reduktante la formadon de artefaktoj34. Konforme al tio, ni observis, ke neŭron-similaj SH-SY5Y-ĉeloj havis sendifektajn subĉelajn organetojn kaj plilongigitajn mitokondriojn (Fig. 1a). Tio elstarigas la utilecon de kriogenaj preparaj teknikoj por studi mitokondrian morfologion en neŭronaj ĉelmodeloj. Kvankam kvantaj mezuradoj estas kritikaj por objektiva analizo de TEM-datumoj, ankoraŭ ne ekzistas konsento pri kiaj specifaj parametroj devus esti mezuritaj por konfirmi mitokondriajn morfologiajn ŝanĝojn. Bazite sur granda nombro da studoj, kiuj kvante ekzamenis mitokondrian morfologion17,31,32, ni evoluigis aŭtomatigitan mitokondrian bildan analizan dukton, kiu mezuras ok morfologiajn parametrojn, nome: areon, areon², bildformaton, perimetron, cirklecon, gradon, Feret-diametron kaj rondecon.
Inter ili, PPA signife reduktis areon 2, areon, perimetron, kaj Feret-diametron (Fig. 1b–e). Ĉi tio montris, ke mitokondrioj fariĝis pli malgrandaj kaj pli rondetaj, kio kongruas kun antaŭaj studoj montrantaj malpliiĝon de mitokondria areo post 72 horoj da PPA30-induktita mitokondria streso. Ĉi tiuj morfologiaj trajtoj povas indiki mitokondrian fision, necesan procezon por sekvestri difektitajn komponantojn de la mitokondria reto por antaŭenigi ilian degeneron per mitofagio35,36,37. Aliflanke, la malpliiĝo de averaĝa mitokondria grandeco povas esti asociita kun pliigita biogenezo, kiu rezultas en la formado de malgrandaj komencantaj mitokondrioj. Pliigita fisio aŭ biogenezo reprezentas kompensan respondon por subteni mitozon kontraŭ mitokondria streso. Tamen, malpliiĝinta mitokondria kresko, difektita fuzio aŭ aliaj kondiĉoj ne povas esti ekskluditaj.
Kvankam la alt-rezoluciaj bildoj kreitaj per TEM permesas la determinadon de morfologiaj karakterizaĵoj je la nivelo de individuaj mitokondrioj, ĉi tiu metodo produktas dudimensiajn momentfotojn je ununura punkto en la tempo. Por studi dinamikajn respondojn al metabola streso, ni kolorigis mitokondriojn per TMRE kaj uzis temp-intervalan mikroskopion kun MEL-analizo, kiu permesas alt-trairan 3D-bildigon de ŝanĝoj en la mitokondria reto laŭlonge de la tempo33,38. Ni observis subtilajn sed signifajn ŝanĝojn en mitokondria dinamiko sub PPA-streso (Fig. 2). Je 3 mM, la nombro de fisio-okazaĵoj signife pliiĝis, dum fuzio-okazaĵoj restis samaj kiel en la kontrolo. Pliiĝo en la nombro de kaj fisio-okazaĵoj kaj fuzio-okazaĵoj estis observita je 5 mM PPA, sed ĉi tiuj ŝanĝoj estis proksimume proporciaj, sugestante ke fisio- kaj fuzio-kinetiko atingas ekvilibron ĉe pli altaj koncentriĝoj (Fig. 2b). La meza mitokondria volumeno restis senŝanĝa je kaj 3 kaj 5 mM PPA, indikante ke la integreco de la mitokondria reto estis konservita (Fig. 2d). Ĉi tio reflektas la kapablon de dinamikaj mitokondriaj retoj respondi al milda metabola streso por efike konservi homeostazon sen kaŭzi retfragmentiĝon. Ĉe 3 mM PPA, la pliiĝo de fisio sufiĉas por antaŭenigi transiron al nova ekvilibro, sed pli profunda kineta remodelado estas necesa en respondo al streso induktita de pli altaj koncentriĝoj de PPA.
La nombro da mitokondrioj pliiĝis ĉe ambaŭ PPA-streskoncentriĝoj, sed la averaĝa mitokondria volumeno ne ŝanĝiĝis signife (Fig. 2c). Ĉi tio povas ŝuldiĝi al pliigita biogenezo aŭ pliigita dividiĝo; tamen, sen signifa malpliiĝo de la averaĝa mitokondria volumeno, estas pli probable, ke biosintezo pliiĝas. Tamen, la datumoj en Figuro 2 subtenas la ekziston de du kompensaj mekanismoj: pliiĝo en la nombro da fisiokazaĵoj, kongrua kun suprenregulado de mitokondria fisio, kaj pliiĝo en la nombro da eventoj, kongrua kun mitokondria biogenezo. Fine, dinamika kompenso por milda streso povas konsisti el samtempaj procezoj implikantaj fision, fuzion, biogenezon kaj mitofagion. Kvankam antaŭaj aŭtoroj montris, ke PPA plifortigas mitozon30,39 kaj mitofagion29, ni provizas pruvojn por remodelado de mitokondria fisio kaj fuzia dinamiko en respondo al PPA. Ĉi tiuj datumoj konfirmas la morfologiajn ŝanĝojn observitajn per TEM kaj provizas plian komprenon pri la mekanismoj asociitaj kun PPA-induktita mitokondria misfunkcio.
Ĉar nek TEM nek MEL-analizo provizis rektan pruvon pri la genaj reguligaj mekanismoj subestantaj la observitajn morfologiajn ŝanĝojn, ni ekzamenis la RNA-esprimon de genoj implikitaj en mitokondria metabolo, biogenezo kaj dinamiko. La cMYC-proto-onkogeno estas transkripcifaktoro implikita en la reguligo de mitokondrioj, glikolizo, aminoacida kaj grasacida metabolo40. Krome, cMYC estas konata pro reguligo de la esprimo de preskaŭ 600 mitokondriaj genoj implikitaj en mitokondria transskribo, traduko kaj kompleksa asembleo, inkluzive de NRF1 kaj TFAM41. NRF1 kaj TFAM estas du centraj reguligantoj de mitozo, agante post PGC-1α por aktivigi mtDNA-replikadon. Ĉi tiu vojo estas aktivigita per cAMP kaj AMPK-signalado kaj estas sentema al energia elspezo kaj metabola streso. Ni ankaŭ ekzamenis NFE2L2, redoksan reguligilon de mitokondria biogenezo, por determini ĉu la efikoj de PPA eble estas mediaciitaj de oksidativa streso.
Kvankam la esprimo de NFE2L2 restis senŝanĝa, ni trovis konstantan doz-dependan malpliiĝon en la esprimo de cMYC, NRF1 kaj TFAM post 24 horoj da traktado kun 3 mM kaj 5 mM PPA (Fig. 3a-c). Malregulado de cMYC-esprimo antaŭe estis raportita kiel respondo al mitokondria streso42, kaj inverse, malsuprenregulado de cMYC-esprimo povas kaŭzi mitokondrian misfunkcion per remodelado de mitokondria metabolo, retkonektebleco kaj membrana polusiĝo43. Interese, cMYC ankaŭ partoprenas en la reguligo de mitokondria fisio kaj fuzio42,43 kaj estas konata pro pliigo de DRP1-fosforilado kaj mitokondria lokalizo dum ĉeldividiĝo44, same kiel mediacio de mitokondria morfologia remodelado en neŭronaj stamĉeloj45. Efektive, cMYC-mankhavaj fibroblastoj montras reduktitan mitokondrian grandecon, konforme al ŝanĝoj induktitaj de PPA43-streso. Ĉi tiuj datumoj ilustras interesan sed ankoraŭ neklaran rilaton inter cMYC kaj mitokondria dinamiko, provizante interesan celon por estontaj studoj pri PPA-streso-induktita remodelado.
La redukto de NRF1 kaj TFAM kongruas kun la rolo de cMYC kiel grava transskriba aktivigilo. Ĉi tiuj datumoj ankaŭ kongruas kun antaŭaj studoj en homaj kojlokanceraj ĉeloj, kiuj montras, ke PPA reduktis NRF1 mRNA-esprimon je 22 horoj, kio estis asociita kun ATP-malplenigo kaj pliigis ROS46. Ĉi tiuj aŭtoroj ankaŭ raportis, ke TFAM-esprimo pliiĝis je 8.5 horoj sed revenis al bazaj niveloj je 22 horoj. Kontraste, Kim et al. (2019) montris, ke TFAM mRNA-esprimo estis signife malpliigita post 4 horoj da PPA-streso en SH-SY5Y-ĉeloj; tamen, post 72 horoj, TFAM-proteina esprimo estis signife pliigita kaj mtDNA-kopionombro estis signife pliigita. Tiel, la malpliiĝo de la nombro de mitokondriaj biogenezaj genoj, kiun ni observis post 24 horoj, ne ekskludas la eblecon, ke la pliiĝo de la nombro de mitokondrioj estas asociita kun aktivigo de biogenezo je pli fruaj tempopunktoj. Antaŭaj studoj montris, ke PPA signife pliigas la kvanton da PGC-1α mRNA kaj proteino en SH-SY5Y-ĉeloj je 4 horoj 30 minutoj, dum propiona acido plifortigas mitokondrian biogenezon en bovidaj hepatocitoj per PGC-1α je 12 horoj 39 minutoj. Interese, PGC-1α ne nur estas rekta transkripcia regulilo de NRF1 kaj TFAM, sed ankaŭ montriĝis reguli la aktivecon de MFN2 kaj DRP1 per reguligo de fisio kaj fuzio47. Sume, ĉi tio elstarigas la proksiman kunigadon de mekanismoj reguligantaj mitokondriajn kompensajn respondojn induktitajn de PPA. Krome, niaj datumoj reflektas signifan misreguligon de transkripcia reguligo de biogenezo kaj metabolo sub PPA-streso.
La genoj STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 kaj DRP1 estas inter la centraj reguliloj de mitokondria fisio, fuzio kaj dinamiko37,48,49. Ekzistas multaj aliaj genoj implikitaj en mitokondria dinamiko, tamen, STOML2, OPA1 kaj MFN2 antaŭe estis trovitaj esti malsame metiligitaj en ASD-kohortoj,16 kaj pluraj sendependaj studoj raportis ŝanĝojn en ĉi tiuj transkripcifaktoroj en respondo al mitokondria streso50,51.52. La esprimo de kaj OPA1 kaj STOML2 estis signife reduktita per 3 mM kaj 5 mM PPA-traktado (Fig. 3e, f). OPA1 estas unu el la klasikaj reguliloj de mitokondria fuzio per rekta interagado kun MFN1 kaj 2 kaj ludas rolon en kresteta remodelado kaj mitokondria morfologio53. La preciza rolo de STOML2 en mitokondria dinamiko restas neklara, sed indicoj sugestas, ke ĝi ludas rolon en mitokondria fuzio, biogenezo kaj mitofagio.
STOML2 partoprenas en la konservado de mitokondria spira kuplado kaj formado de spiraj ĉenkompleksoj54,55 kaj montriĝis profunde ŝanĝi la metabolajn karakterizaĵojn de kanceraj ĉeloj56. Studoj montris, ke STOML2 antaŭenigas mitokondrian membranpotencialon kaj biogenezon per interagado kun BAN kaj kardiolipino 55, 57, 58. Plie, sendependaj studoj montris, ke la interagado inter STOML2 kaj PINK1 reguligas mitofagion59,60. Rimarkinde, laŭ raportoj, STOML2 rekte interagas kun kaj stabiligas MFN2 kaj ankaŭ ludas gravan rolon en stabiligado de longaj OPA1-izoformoj per inhibicio de la proteazo respondeca pri OPA1-degradado53,61,62. La redukto de STOML2-esprimo observita en PPA-reagoj povas igi ĉi tiujn fuziajn proteinojn pli sentemaj al degradado per ubikvitin- kaj proteazom-dependaj vojoj48. Kvankam la preciza rolo de STOML2 kaj OPA1 en la dinamika respondo al PPA estas neklara, malpliiĝinta esprimo de ĉi tiuj fuziaj genoj (Figuro 3) povas interrompi la ekvilibron inter fisio kaj fuzio kaj konduki al malpliiĝinta mitokondria grandeco (Figuro 3). 1).
Aliflanke, la proteina esprimo de OPA1 restis senŝanĝa post 24 horoj, dum la mRNA kaj proteinaj niveloj de MFN1, MFN2 aŭ DRP1 ne ŝanĝiĝis signife post PPA-traktado (Fig. 3g-i, Fig. 4). Ĉi tio povas indiki, ke ne estas ŝanĝoj en la reguligo de ĉi tiuj faktoroj implikitaj en mitokondria fuzio kaj fisio. Tamen, indas rimarki, ke ĉiu el ĉi tiuj kvar genoj estas ankaŭ reguligita per posttransskribaj modifoj (PTM-oj), kiuj kontrolas proteinan agadon. OPA1 havas ok alternativajn splisajn variaĵojn, kiuj estas proteolitike fenditaj en mitokondrioj por produkti du apartajn izoformojn 63. La ekvilibro inter longaj kaj mallongaj izoformoj finfine determinas la rolon de OPA1 en mitokondria fuzio kaj bontenado de la mitokondria reto 64. DRP1-aktiveco estas reguligita per kalcio/kalmodulin-dependa proteinkinazo II (CaMKII) fosforiligo, dum DRP1-degenero estas reguligita per ubikvitinigo kaj SUMOiligo 65. Fine, kaj DRP1 kaj MFN1/2 estas GTPazoj, do la aktiveco povas esti influita de la rapideco de GTP-produktado en mitokondrioj 66. Tial, kvankam la esprimo de ĉi tiuj proteinoj restas konstanta, tio eble ne reflektas senŝanĝan proteinan aktivecon aŭ lokalizon 67,68. Efektive, ekzistantaj PTM-proteinaj repertuaroj ofte servas kiel la unua defendlinio respondeca pri mediacio de akutaj stresrespondoj. Ĉeestante modera metabola streso en nia modelo, estas probable, ke PTM antaŭenigas pliigitan aktivecon de fuziaj kaj fisioproteinoj por sufiĉe restarigi mitokondrian integrecon sen postuli plian aktivigon de ĉi tiuj genoj je la mRNA- aŭ proteina nivelo.
Sume, la supraj datumoj elstarigas la kompleksan kaj tempodependan reguligon de mitokondria morfologio kaj la defiojn klarigi ĉi tiujn mekanismojn. Por studi genekspresion, unue necesas identigi specifajn celgenojn en la mitokondria vojo. Tamen, niaj datumoj montras, ke genoj en la sama vojo ne reagas sammaniere al la sama streso. Fakte, antaŭaj studoj montris, ke malsamaj genoj en la sama vojo povas montri malsamajn tempajn respondprofilojn30,46. Krome, ekzistas kompleksaj post-transskribaj mekanismoj, kiuj interrompas la rilaton inter transskribo kaj genfunkcio. Proteomikaj studoj povas provizi komprenon pri la efiko de PTM-oj kaj proteina funkcio, sed ili ankaŭ prezentas defiojn, inkluzive de malalt-trairaj metodoj, altaj signalo-bruo-proporcioj kaj malbona distingivo.
En ĉi tiu kunteksto, studi mitokondrian morfologion per TEM kaj MEL havas grandan potencialon por trakti fundamentajn demandojn pri la rilato inter mitokondria dinamiko kaj funkcio kaj kiel tio influas malsanojn. Plej grave, TEM provizas rektan metodon por mezuri mitokondrian morfologion kiel konverĝan finpunkton de mitokondria misfunkcio kaj dinamiko51. MEL ankaŭ provizas rektan metodon por bildigi fisio- kaj fuzio-okazaĵojn en tridimensia ĉela medio, permesante kvantigon de dinamika mitokondria remodelado eĉ en la foresto de ŝanĝoj en gena esprimo33. Ĉi tie ni elstarigas la utilecon de mitokondriaj bildigaj teknikoj en sekundaraj mitokondriaj malsanoj. Ĉi tiuj malsanoj estas tipe karakterizitaj per kronika milda metabola streso karakterizita per subtila remodelado de mitokondriaj retoj prefere ol akuta mitokondria difekto. Tamen, la mitokondria kompenso necesa por konservi mitozon sub kronika streso havas profundajn funkciajn konsekvencojn. En la kunteksto de neŭroscienco, pli bona kompreno de ĉi tiuj kompensaj mekanismoj povas provizi gravajn informojn pri la plejotropa neŭropatologio asociita kun mitokondria misfunkcio.
Fine, niaj datumoj elstarigas la utilecon de bildigaj teknikoj por kompreni la funkciajn sekvojn de la kompleksaj interagoj inter gena esprimo, proteinaj modifoj kaj proteina aktiveco, kiuj kontrolas neŭronan mitokondrian dinamikon. Ni uzis PPA por modeli mitokondrian misfunkcion en neŭrona ĉelmodelo por akiri komprenon pri la mitokondria komponanto de aŭtisma spektroskopio (ASD). SH-SY5Y-ĉeloj traktitaj per PPA montris ŝanĝojn en mitokondria morfologio: mitokondrioj fariĝis malgrandaj kaj rondaj, kaj krestetoj estis malbone difinitaj kiam observitaj per TEM. MEL-analizo montras, ke ĉi tiuj ŝanĝoj okazas samtempe kun pliiĝo de fisio- kaj fuzio-okazaĵoj por konservi la mitokondrian reton en respondo al milda metabola streso. Krome, PPA signife interrompas la transskriban reguligon de mitokondria metabolo kaj homeostazo. Ni identigis cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 kaj OPA1 kiel ŝlosilajn mitokondriajn regulilojn interrompitajn de PPA-streso kaj povas ludi rolon en mediaciado de PPA-induktitaj ŝanĝoj en mitokondria morfologio kaj funkcio. Estontaj studoj estas necesaj por pli bone karakterizi PPA-induktitajn tempajn ŝanĝojn en gena esprimo kaj proteina aktiveco, lokalizo kaj post-tradukaj modifoj. Niaj datumoj elstarigas la kompleksecon kaj interdependon de la reguligaj mekanismoj mediaciantaj la mitokondrian stresrespondon kaj montras la utilecon de TEM kaj aliaj bildigaj teknikoj por pli celitaj mekanismaj studoj.
La ĉellinio SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) estis aĉetita de Sigma-Aldrich. SH-SY5Y-ĉeloj estis kreskigitaj en Dulbecco's modified Eagle's medium/F-12 nutraĵmiksaĵo (DMEM/F-12) kaj L-glutamino (SC09411, ScienCell) en 25 cm²-aj flakonoj suplementitaj per 20% feta bova serumo (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) kaj 1% penicilino-streptomicino (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) je 37 °C, 5% CO2. La ĉeloj estis subkulturitaj ĝis 80% konfluenco uzante 0,05% tripsino-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), centrifugitaj je 300 g kaj tegitaj je denseco de proksimume 7 × 10⁵ ĉeloj/ml. Ĉiuj eksperimentoj estis faritaj sur nediferencigitaj SH-SY5Y-ĉeloj inter la trairejoj 19–22. PPA estas administrata kiel NaP. Dissolvu NaP-pulvoron (CAS-numero 137-40-6, kemia formulo C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) en varma MilliQ-akvo ĝis koncentriĝo de 1 M kaj konservu je 4 °C. En la tago de la traktado, diluigu ĉi tiun solvaĵon per 1 M PPA ĝis 3 mM kaj 5 mM PPA en serum-libera medio (DMEM/F-12 kun L-glutamino). La traktado-koncentriĝoj por ĉiuj eksperimentoj estis sen PPA (0 mM, kontrolo), 3 mM, kaj 5 mM PPA. Eksperimentoj estis faritaj en almenaŭ tri biologiaj ripetoj.
SH-SY5Y-ĉeloj estis semitaj en 25 cm⁻¹-ajn flakonojn je rapideco de 5,5 × 10⁵ ĉeloj/ml kaj kreskigitaj dum 24 horoj. La PPA-traktado estis aldonita al la flakono antaŭ 24 horoj da inkubacio. Kolektu la ĉelbuletojn laŭ la normalaj protokoloj por mamulaj histaj subkultivaĵoj (priskribitaj supre). Resuspendu la ĉelbuleton en 100 µl da 2,5% glutaraldehido, 1× PBS kaj konservu je 4 °C ĝis prilaborado. SH-SY5Y-ĉeloj estis nelonge centrifugitaj por peleti la ĉelojn kaj forigi 2,5% glutaraldehidon, 1× PBS-solvaĵon. Resuspendu la sedimenton en 4%-agaroza ĝelo preparita en distilita akvo (la proporcio de agarozo al sedimenta volumeno estas 1:1). Agarozaj pecoj estis metitaj sur kradojn sur ebenaj platoj kaj kovritaj per 1-heksadeceno antaŭ altprema frostigado. Specimenoj estis frostigitaj en 100% seka acetono je -90 °C dum 24 horoj. La temperaturo estis poste levita ĝis -80 °C kaj solvaĵo de 1% da osmiotetraoksido kaj 0,1% da glutaraldehido estis aldonita. La specimenoj estis konservitaj je -80 °C dum 24 horoj. Post tio, la temperaturo estis iom post iom pliigita ĝis ĉambra temperaturo dum pluraj tagoj: de – 80 °C ĝis – 50 °C dum 24 horoj, ĝis – 30 °C dum 24 horoj, ĝis – 10 °C dum 24 horoj kaj fine ĝis ĉambra temperaturo.
Post kriogena preparo, la specimenoj estis impregnitaj per rezino kaj ultramaldikaj sekcioj (∼100 nm) estis faritaj uzante Leica Reichert UltracutS ultramikrotomon (Leica Microsystems). Sekcioj estis koloritaj per 2% uranila acetato kaj plumba citrato. Specimenoj estis observitaj uzante FEI Tecnai 20 transmisian elektronan mikroskopon (ThermoFisher (antaŭe FEI), Eindhoven, Nederlando) funkciantan je 200 kV (Lab6-dissendilo) kaj Gatan CCD-fotilon (Gatan, Britio) ekipitan per Tridiem-energia filtrilo.
En ĉiu teknika ripeto, almenaŭ 24 bildoj de unuopaj ĉeloj estis akiritaj, por entute 266 bildoj. Ĉiuj bildoj estis analizitaj uzante la makroon Regiono de Intereso (ROI) kaj la makroon Mitokondrio. La mitokondria makro baziĝas sur publikigitaj metodoj17,31,32 kaj permesas duonaŭtomatan aro-prilaboradon de TEM-bildoj en Fiji/ImageJ69. Mallonge: la bildo estas renversita kaj renversita uzante subtrahon de ruliĝanta pilko en fono (radiuso de 60-piksela) kaj FFT-bendpasan filtrilon (uzante suprajn kaj malsuprajn limojn de 60 kaj 8-pikseloj respektive) kaj subpremadon de vertikala linio kun orientiĝa toleremo de 5%. La prilaborita bildo estas aŭtomate sojlita uzante algoritmon de maksimuma entropio kaj binara masko estas generita. Bildregionoj asociitaj kun mane elektitaj ROI-oj en krudaj TEM-bildoj estis eltiritaj, karakterizante mitokondriojn kaj ekskludante la plasmomembranon kaj aliajn alt-kontrastajn regionojn. Por ĉiu ekstraktita ROI, duumaj partikloj pli grandaj ol 600 pikseloj estis analizitaj, kaj partikla areo, perimetro, granda kaj malgranda akso, Feret-diametro, rondeco kaj cirkleco estis mezuritaj uzante la enkonstruitajn mezurfunkciojn de Fiji/ImageJ. Sekvante Merrill, Flippo kaj Strack (2017), areo 2, partikla bildformato (proporcio inter granda kaj malgranda akso) kaj formofaktoro (FF) estis kalkulitaj el ĉi tiuj datumoj, kie FF = perimetro 2/4pi x areo. La difino de la parametrika formulo troveblas en Merrill, Flippo kaj Strack (2017). La menciitaj makrooj estas haveblaj ĉe GitHub (vidu Deklaron pri Datuma Havebleco). Averaĝe, ĉirkaŭ 5 600 partikloj estis analizitaj por ĉiu PPA-traktado, por totalo de ĉirkaŭ 17 000 partikloj (datumoj ne montritaj).
SH-SH5Y-ĉeloj estis metitaj en 8-kamerajn kulturpladojn (ThermoFisher, #155411) por permesi adheron dumnokte kaj poste inkubaciitaj per TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) kaj Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Bildoj estis akiritaj uzante 405 nm kaj 561 nm laserojn dum 10-minuta medio, kaj krudaj bildoj estis akiritaj kiel z-stakoj enhavantaj 10 bildmikrografojn kun az-paŝo de 0.2 μm inter bildkadroj je 12 postaj tempopunktoj. Bildoj estis kolektitaj uzante super-rezolucian platformon Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germanio) uzante LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 lenson. Bildoj estis analizitaj en ImageJ uzante antaŭe priskribitan dukton kaj la kromprogramon ImageJ por mezuri fuziajn kaj fisio-okazaĵojn, averaĝan nombron de mitokondriaj strukturoj, kaj averaĝan mitokondrian volumenon po ĉelo33. MEL-makrooj estas haveblaj ĉe GitHub (vidu Deklaron pri Datuma Havebleco).
SH-SY5Y-ĉeloj estis kreskigitaj en ses-putaj platoj je denseco de 0.3 × 10⁶ ĉeloj/mL dum 24 horoj antaŭ la traktado. RNA estis ekstraktita uzante la protokolon Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) kun iometaj modifoj: aldonu 300 μl da RNA-liza bufro al ĉiu puto antaŭ forigo kaj lizu ĉiun specimenon kiel finan paŝon per 30 μl da DNase/RNase-eluado. -libera akvo. Ĉiuj specimenoj estis kontrolitaj pri kvanto kaj kvalito uzante NanoDrop ND-1000 UV-Vis Spektrofotometron. Totala proteino el ĉellizaĵoj estis akirita uzante 200 μl da RIPA-liza bufro, kaj proteina koncentriĝo estis kvantigita uzante la Bradford-proteinan analizon70.
cDNA-sintezo estis plenumita uzante la Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) laŭ la instrukcioj de la fabrikanto kun kelkaj modifoj. cDNA estis sintezita en 20-μl reakcioj uzante 0,7 ĝis 1 μg da totala RNA. Prajmeroj estis elektitaj el antaŭe publikigitaj artikoloj 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabelo S1) kaj akompanaj sondiloj estis desegnitaj uzante la ilon PrimerQuest de Integrated DNA Technologies. Ĉiuj interesaj genoj estis normaligitaj al la nuklea geno B2M. La gena esprimo de STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC kaj OPA1 estis mezurita per RT-qPCR. La ĉefa miksaĵo inkluzivis LUNA Taq-polimerazon (M3003L, New England Biolabs), 10 μM antaŭen kaj inversen komencilojn, cDNA, kaj PCR-kvalitan akvon por doni finan volumenon de 10 μL por ĉiu reakcio. Esprimo de diviziaj kaj fisiogenoj (DRP1, MFN1/2) estis mezurita uzante TaqMan-multipleksajn analizojn. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) estis uzata laŭ la instrukcioj de la fabrikanto kun malgrandaj modifoj. La multpleksa RT-qPCR-ĉefa miksaĵo inkluzivas 1X LUNA Taq-polimerazon, 10 μM antaŭen kaj inversen komencilojn, 10 μM sondilon, cDNA, kaj PCR-kvalitan akvon, rezultante en fina volumeno de 20 μL por ĉiu reakcio. RT-qPCR estis plenumita uzante Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG - seria numero: R0618110). Ciklaj kondiĉoj estas montritaj en Tabelo S1. Ĉiuj cDNA-specimenoj estis amplifitaj trioble kaj norma kurbo estis generita uzante serion de dekoblaj diluoj. Eksterordinaraj valoroj en trioblaj specimenoj kun cikla sojla norma devio (Ct) >0.5 estis forigitaj de la analizo por certigi datenreprodukteblecon30,72. Relativa genekspresio estis kalkulita uzante la 2-ΔΔCt79-metodon.
Proteinaj specimenoj (60 μg) estis miksitaj kun Laemmli-ŝarĝa bufro je proporcio de 2:1 kaj prilaboritaj sur 12% senkolora proteina ĝelo (Bio-Rad #1610184). Proteinoj estis translokigitaj al PVDF (polivinilidenfluorido) membrano (#170-84156, Bio-Rad) uzante la Trans-Blot Turbo sistemon (#170-4155, Bio-Rad). La membrano estis blokita kaj inkubita kun la taŭgaj primaraj antikorpoj (OPA1, MFN1, MFN2, kaj DRP1) (diluitaj 1:1000) dum 48 horoj, sekvata de inkubacio kun sekundaraj antikorpoj (1:10,000) dum 1 horo. Membranoj estis poste bildigitaj uzante Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) kaj registritaj uzante Bio-Rad ChemiDoc MP sistemon. ImageLab versio 6.1 estis uzata por okcidenta blotanalizo. La originala ĝelo kaj makulo estas montritaj en Figuro S1. Informoj pri antikorpoj estas provizitaj en Tabelo S2.
Daten-aroj estas prezentitaj kiel la meznombro kaj norma eraro de la meznombro (SEM) de almenaŭ tri sendependaj specimenoj. Daten-aroj estis testitaj pri normaleco uzante la Shapiro-Wilks-teston (krom se alie deklarite) antaŭ ol supozi Gaŭsan distribuon kaj egalajn normajn deviojn kaj daŭrigi per la analizoj. Aldone al analizo de la datenaro, oni uzis la MEL LSD de Fisher (p < 0.05), unudirektan ANOVA (traktado kontraŭ kontrola meznombro), kaj la multoblan komparan teston de Dunnett por determini signifon (p < 0.05). Signifaj p-valoroj estas montritaj en la grafikaĵo kiel *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Ĉiuj statistikaj analizoj kaj grafikaĵoj estis faritaj kaj generitaj uzante GraphPad Prism 9.4.0.
Makrooj Fiji/ImageJ por TEM-bildanalizo estas publike haveblaj ĉe GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. La makroo Mitochondrial Event Locator (MEL) estas publike havebla ĉe GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM kaj Vijaya A. Mitokondrioj: ĉefaj reguliloj de metabolo, homeostazo, streso, maljuniĝo kaj epigenetiko. Indonezia. Biomedicina Scienco. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Multfaceta mitokondria misfunkcio en skizofrenio, komplekso I kiel ebla patologia celo. Skizofrenio. rimedo. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. kaj Beal, MF Mitokondria misfunkcio en Parkinson-malsano. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG kaj Mehta V. Stresitaj mitokondrioj: celoj de invado en Alzheimer-malsano. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF kaj Ferreira GK Mitokondrioj kaj la cerbo: bioenergetiko kaj pli. Neŭrotoksinoj. rimedo. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Plejotropaj mitokondrioj: la efiko de mitokondrioj sur neŭrona disvolviĝo kaj malsano. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. kaj Morais, VA Mitokondria biogenezo en neŭronoj: kiel kaj kie. Internacieco. J. Mohr. La scienco. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. kaj Zhao, J. Reguligo de mamula mitokondria dinamiko: ŝancoj kaj defioj. front. endokrina. (Laŭzano) 11, 374 (2020).
Khacho, M. kaj Slack, RS Mitokondria dinamiko en la reguligo de neŭrogenezo: de la evoluanta ĝis plenkreska cerbo. disvolviĝo. dinamiko. 247, 47–53 (2018).