Dankon pro via vizito al Nature.com. La retumilversio, kiun vi uzas, havas limigitan subtenon por CSS. Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu kongruecan reĝimon en Internet Explorer). Dume, por certigi daŭran subtenon, ni montros la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Insulinnanopartikloj (NP) kun alta ŝarĝenhavo trovis diversajn aplikojn en diversaj dozaj formoj. Ĉi tiu laboro celas taksi la efikon de liofilizado kaj ŝprucsekigado sur la strukturo de insulin-ŝarĝitaj kitosanaj nanopartikloj, kun aŭ sen manitolo kiel krioprotektanto. Ni ankaŭ taksis la kvaliton de ĉi tiuj nanopartikloj per redissolvado de ili. Antaŭ dehidratiĝo, la partikla grandeco de la kitosano/natria tripolifosfato/insulino krucligitaj nanopartikloj estis optimumigita por esti 318 nm, la PDI estis 0.18, la enkapsuliga efikeco estis 99.4%, kaj la ŝarĝo estis 25.01%. Post rekonstruo, ĉiuj nanopartikloj, krom tiuj produktitaj per liofilizado sen la uzo de manitolo, konservis sian sferan partiklan strukturon. Kompare kun manitol-entenantaj nanopartikloj dehidratigitaj per ambaŭ ŝprucoj, manitol-liberaj ŝprucsekigitaj nanopartikloj ankaŭ montris la plej malgrandan averaĝan partiklan grandecon (376 nm) kaj la plej altan ŝarĝenhavon. (25.02%) kun simila enkapsuliga indico (98.7%) kaj PDI (0.20) per sekigado aŭ liofilizado. La sekigitaj nanopartikloj per ŝprucsekigado sen manitolo ankaŭ rezultigis la plej rapidan liberigon de insulino kaj la plej altan efikecon de ĉela sorbado. Ĉi tiu laboro montras, ke ŝprucsekigado povas senakvigi insulinnanopartiklojn sen la bezono de krioprotektantoj kompare kun konvenciaj liofilizadometodoj, kreante pli grandan ŝarĝkapaciton, pli malaltajn aldonaĵajn postulojn kaj signifan avantaĝon de funkciigaj kostoj.
Ekde sia malkovro en 19221,2,3, insulino kaj ĝiaj farmaciaj preparoj savis la vivojn de pacientoj kun tipo 1 diabeto (T1DM) kaj tipo 2 diabeto (T1DM). Tamen, pro siaj ecoj kiel altmolekula proteino, insulino facile agregiĝas, malkomponiĝas per proteolizaj enzimoj, kaj eliminiĝas per la unua-pasa efiko. Homoj diagnozitaj kun tipo 1 diabeto bezonas insulininjektojn por la resto de siaj vivoj. Multaj pacientoj komence diagnozitaj kun tipo 2 diabeto ankaŭ bezonas longdaŭrajn insulininjektojn. Ĉiutagaj insulininjektoj estas grava fonto de ĉiutaga doloro kaj malkomforto por ĉi tiuj individuoj, kun negativaj efikoj sur mensa sano. Rezulte, aliaj formoj de insulinadministrado, kiuj kaŭzas malpli da malkomforto, kiel ekzemple parola insulinadministrado, estas vaste studataj5, ĉar ili havas la potencialon restarigi la vivokvaliton de proksimume 5 miliardoj da homoj kun diabeto tutmonde.
Nanopartikla teknologio provizis signifan progreson en provoj preni buŝan insulinon4,6,7. Ĝi efike enkapsuligas kaj protektas insulinon de degenero por celita liverado al specifaj korpaj lokoj. Tamen, la uzo de nanopartiklaj formuloj havas plurajn limigojn, ĉefe pro stabilecaj problemoj de partiklaj suspendoj. Iom da agrego povas okazi dum stokado, kio reduktas la biohaveblecon de insulin-ŝarĝitaj nanopartikloj8. Krome, la kemia stabileco de la polimera matrico de nanopartikloj kaj insulino ankaŭ devas esti konsiderata por certigi la stabilecon de insulinnanopartikloj (NP). Nuntempe, liofilizado-teknologio estas la ora normo por krei stabilajn NP-ojn, samtempe malhelpante nedeziratajn ŝanĝojn dum stokado9.
Tamen, liofilizado postulas la aldonon de krioprotektantoj por malhelpi la sferan strukturon de nanopartikloj esti trafita de la mekanika streĉo de glacikristaloj. Ĉi tio signife reduktas la ŝarĝon de insulinnanopartikloj post liofiligo, ĉar la krioprotektanto okupas la plejparton de la pezproporcio. Tial, la produktitaj insulinnanopartikloj ofte troviĝas netaŭgaj por la fabrikado de sekaj pulvoraj formuliĝoj, kiel ekzemple buŝaj tablojdoj kaj buŝaj filmoj, pro la bezono de grandaj kvantoj da sekaj nanopartikloj por atingi la terapian fenestron de insulino.
Ŝprucsekigado estas konata kaj malmultekosta industri-skala procezo por produkti sekajn pulvorojn el likvaj fazoj en la farmacia industrio10,11. Kontrolo super la partikla formiĝprocezo permesas ĝustan enkapsuligon de pluraj bioaktivaj kombinaĵoj12, 13. Krome, ĝi fariĝis efika tekniko por la preparado de enkapsuligitaj proteinoj por buŝa administrado. Dum ŝprucsekigado, akvo vaporiĝas tre rapide, kio helpas teni la temperaturon de la partikla kerno malalta11,14, ebligante ĝian aplikon por enkapsuligi varmosentemajn komponantojn. Antaŭ ŝprucsekigado, la tegaĵa materialo devas esti plene homogenigita kun la solvaĵo enhavanta la enkapsuligitajn ingrediencojn11,14. Male al liofilizado, homogenizado antaŭ enkapsuligo en ŝprucsekigado plibonigas la enkapsuligan efikecon dum dehidratiĝo. Ĉar la ŝprucsekiga enkapsuliga procezo ne postulas krioprotektantojn, ŝprucsekigado povas esti uzata por produkti sekigitajn NP-ojn kun alta ŝarĝenhavo.
Ĉi tiu studo raportas la produktadon de insulin-ŝarĝitaj nanopartikloj per krucligado de kitosano kaj natria tripolifosfato uzante jonan ĝelmetodon. Jona ĝeligo estas preparmetodo, kiu permesas la produktadon de nanopartikloj per elektrostatikaj interagoj inter du aŭ pli jonaj specioj sub certaj kondiĉoj. Kaj liofilizado kaj ŝprucsekigado estis uzitaj por senakvigi la optimumigitajn kitosan/natrian tripolifosfaton/insulinon krucligitajn nanopartiklojn. Post senakvigo, ilia morfologio estis analizita per SEM. Ilia rekombiniga kapablo estis taksita per mezurado de ilia grandecdistribuo, surfaca ŝargo, PDI, enkapsuliga efikeco kaj ŝarĝenhavo. La kvalito de resolubligitaj nanopartikloj produktitaj per malsamaj senakvigaj metodoj ankaŭ estis taksita komparante ilian insulinprotekton, liberigan konduton kaj ĉelan sorbadon.
La pH de la miksita solvaĵo kaj la proporcio de kitosano kaj insulino estas du ŝlosilaj faktoroj, kiuj influas la partiklan grandecon kaj enkapsuligan efikecon (EE) de la finaj nanopartikloj, ĉar ili rekte influas la jonotropan ĝeligan procezon. La pH de la miksita solvaĵo montriĝis tre korelaciita kun partikla grandeco kaj enkapsuliga efikeco (Fig. 1a). Kiel montrite en Fig. 1a, kiam pH pliiĝis de 4.0 al 6.0, la averaĝa partikla grandeco (nm) malpliiĝis kaj la EE pliiĝis signife, dum kiam la pH pliiĝis al 6.5, la averaĝa partikla grandeco komencis pliiĝi kaj la EE restis senŝanĝa. Kiam la proporcio de kitosano al insulino pliiĝas, la averaĝa partikla grandeco ankaŭ pliiĝas. Krome, neniu ŝanĝo en EE estis observita kiam nanopartikloj estis preparitaj je masa proporcio de kitosano/insulino pli alta ol 2.5:1 (p/p) (Fig. 1b). Tial, la optimumaj preparaj kondiĉoj en ĉi tiu studo (pH 6.0, masa proporcio de kitosano/insulino de 2.5:1) estis uzitaj. prepari insulin-ŝarĝitajn nanopartiklojn por plia studo. Sub ĉi tiu preparkondiĉo, la averaĝa partikla grandeco de insulinaj nanopartikloj estis optimumigita por esti 318 nm (Fig. 1c), la PDI estis 0.18, la enkorpiga efikeco estis 99.4%, la zeta-potencialo estis 9.8 mv, kaj la insulinŝarĝo estis 25.01% (m/m). Surbaze de rezultoj de transmisia elektrona mikroskopio (TEM), la optimumigitaj nanopartikloj estis proksimume sferaj kaj diskretaj kun relative unuforma grandeco (Fig. 1d).
Parametra optimumigo de insulinaj nanopartikloj: (a) la efiko de pH sur la meza diametro kaj enkapsuliga efikeco (EE) de insulinaj nanopartikloj (preparitaj je 5:1 masa proporcio de kitosano kaj insulino); (b) kitosano kaj Influo de la masa proporcio de insulino sur la meza diametro kaj enkapsuliga efikeco (EE) de insulinaj nanopartikloj (preparitaj je pH 6); (c) partikla grandecdistribuo de optimumigitaj insulinaj nanopartikloj; (d) TEM-mikrografo de optimumigitaj insulinaj nanopartikloj.
Estas bone konate, ke kitosano estas malforta polielektrolito kun pKa de 6.5. Ĝi estas pozitive ŝargita en acidaj medioj ĉar ĝia ĉefa amino-grupo estas protonigita de hidrogenaj jonoj15. Tial, ĝi ofte estas uzata kiel portanto por enkapsuligi negative ŝargitajn makromolekulojn. En ĉi tiu studo, kitosano estis uzata por enkapsuligi insulinon kun izoelektra punkto de 5.3. Ĉar kitosano estas uzata kiel tegaĵa materialo, kun la pliiĝo de ĝia proporcio, la dikeco de la ekstera tavolo de la nanopartikloj pliiĝas koresponde, rezultante en pli granda averaĝa partikla grandeco. Krome, pli altaj niveloj de kitosano povas enkapsuligi pli da insulino. En nia kazo, EE estis plej alta kiam la proporcio de kitosano kaj insulino atingis 2.5:1, kaj ne estis signifa ŝanĝo en EE kiam la proporcio daŭre pliiĝis.
Krom la proporcio de kitosano kaj insulino, la pH ankaŭ ludis gravan rolon en la preparado de nanopartikloj. Gan et al. [17] studis la efikon de pH sur la partikla grandeco de kitosanaj nanopartikloj. Ili trovis kontinuan malpliiĝon de partikla grandeco ĝis pH atingis 6.0, kaj signifan pliiĝon de partikla grandeco oni observis ĉe pH > 6.0, kio kongruas kun niaj observoj. Ĉi tiu fenomeno ŝuldiĝas al la fakto, ke kun kreskanta pH, la insulinmolekulo akiras negativan surfacan ŝargon, tiel favorante elektrostatikajn interagojn kun la kitosano/natria tripolifosfata (TPP) komplekso, rezultante en malgranda partikla grandeco kaj alta EE. Tamen, kiam la pH estis alĝustigita al 6.5, la amino-grupoj sur kitosano estis deprotonigitaj, rezultante en kitosana faldado. Tiel, alta pH rezultigas malpli da eksponiĝo de amino-jonoj al TPP kaj insulino, rezultante en pli malalta krucligado, pli granda fina averaĝa partikla grandeco kaj pli malalta EE.
Analizo de la morfologiaj ecoj de frostig-sekigitaj kaj ŝpruc-sekigitaj nanopartikloj povas gvidi la elekton de pli bonaj teknikoj por dehidratiĝo kaj pulvorformado. La preferata metodo devus provizi drogstabilecon, unuforman partiklan formon, altan drogŝarĝon kaj bonan solveblecon en la originala solvaĵo. En ĉi tiu studo, por pli bone kompari la du teknikojn, insulinaj nanopartikloj kun aŭ sen 1% manitolo estis uzitaj dum dehidratiĝo. Manitolo estas uzata kiel plenigaĵo aŭ krioprotektanto en diversaj sekaj pulvoraj formuloj por frostig-sekigado kaj ŝpruc-sekigado. Por la liofiligitaj insulinaj nanopartikloj sen manitolo, kiel montrite en Figuro 2a, tre pora pulvora strukturo kun grandaj, neregulaj kaj malglataj surfacoj estis observita sub skana elektrona mikroskopio (SEM). Malmultaj diskretaj partikloj estis detektitaj en la pulvoro post dehidratiĝo (Fig. 2e). Ĉi tiuj rezultoj indikis, ke plej multaj nanopartikloj estis malkomponitaj dum frostig-sekigado sen iu ajn krioprotektanto. Por frostig-sekigitaj kaj ŝpruc-sekigitaj insulinaj nanopartikloj enhavantaj 1% manitolon, sferaj nanopartikloj kun glataj surfacoj estis observitaj (Fig. 2b,d,f,h). Insulinnanopartikloj ŝprucsekigitaj sen manitolo restis sferaj sed sulkiĝintaj sur la surfaco (Fig. 2c). Sferaj kaj sulkiĝintaj surfacoj estas plue diskutitaj en la testoj pri liberiga konduto kaj ĉela sorbado sube. Surbaze de la videbla aspekto de la sekigitaj nanopartikloj, kaj ŝprucsekigitaj nanopartikloj sen manitolo kaj nanopartikloj frostig-sekigitaj kaj ŝprucsekigitaj kun manitolo produktis fajnajn nanopartiklojn en pulvoro (Fig. 2f,g,h). Ju pli granda la surfacareo inter la partiklaj surfacoj, des pli alta la solvebleco kaj tial des pli alta la liberiga rapideco.
Morfologio de diversaj senakvigitaj insulinaj nanopartikloj: (a) SEM-bildo de liofiligitaj insulinaj nanopartikloj sen manitolo; (b) SEM-bildo de liofiligitaj insulinaj nanopartikloj kun manitolo; (c) ŝprucsekigitaj insulinaj nanopartikloj sen manitolo SEM-bildo de; (d) SEM-bildo de insulinaj nanopartikloj ŝprucsekigitaj kun manitolo; (e) bildo de liofiligita insulina nanopartikla pulvoro sen manitolo; (f) bildo de liofiligitaj insulinaj nanopartikloj kun manitolo; (g) Bildo de ŝprucsekigita insulina nanopartikla pulvoro sen manitolo; (h) bildo de ŝprucsekigita insulina nanopartikla pulvoro kun manitolo.
Dum liofilizado, manitolo agas kiel krioprotektanto, tenante nanopartiklojn en amorfa formo kaj malhelpante damaĝon per glacikristaloj19. Kontraste, ne estas frostiga paŝo dum ŝprucsekigado. Tial manitolo ne estas necesa en ĉi tiu metodo. Fakte, ŝprucsekigitaj nanopartikloj sen manitolo produktis pli fajnajn nanopartiklojn kiel antaŭe priskribite. Tamen, manitolo ankoraŭ povas agi kiel plenigaĵo en la ŝprucsekiga procezo por doni al nanopartikloj pli sferan strukturon20 (Fig. 2d), kiu helpas atingi unuforman liberigan konduton de tiaj enkapsuligitaj nanopartikloj. Krome, estas klare, ke iuj grandaj partikloj povas esti detektitaj en kaj liofiligitaj kaj ŝprucsekigitaj insulinaj nanopartikloj enhavantaj manitolon (Fig. 2b,d), kio povas ŝuldiĝi al la amasiĝo de manitolo en la partikla kerno kune kun la enkapsuligita insulino. Al.Kitosana tavolo.Indas rimarki, ke en ĉi tiu studo, por certigi, ke la sfera strukturo restas sendifekta post dehidratiĝo, la proporcio de manitolo kaj kitosano estas tenata je 5:1, tiel ke granda kvanto da plenigaĵo ankaŭ povas pligrandigi la partiklan grandecon de la sekigitaj NP-oj.
Fourier-transforma infraruĝa malfortigita totala reflekta (FTIR-ATR) spektroskopio karakterizis la fizikan miksaĵon de libera insulino, kitosano, kitosano, TPP kaj insulino. Ĉiuj senakvigitaj nanopartikloj estis karakterizitaj per FTIR-ATR spektroskopio. Rimarkinde, bendintensecoj de 1641, 1543 kaj 1412 cm⁻¹ estis observitaj en enkapsuligitaj nanopartikloj frostig-sekigitaj kun manitolo kaj en nanopartikloj ŝpruc-sekigitaj kun kaj sen manitolo (Fig. 3). Kiel antaŭe raportite, ĉi tiuj pliiĝoj en forto estis asociitaj kun krucligado inter kitosano, TPP kaj insulino. Esploro pri la interago inter kitosano kaj insulino montris, ke en la FTIR-spektroj de insulin-ŝarĝitaj kitosanaj nanopartikloj, la kitosana bendo interkovris kun tiu de insulino, pliigante la karbonilan intensecon (1641 cm⁻¹) kaj la aminan (1543 cm⁻¹) zonon. La tripolifosfataj grupoj de TPP estas ligitaj al amoniaj grupoj en kitosano. formante bendon je 1412 cm-1.
FTIR-ATR-spektroj de libera insulino, kitosano, fizikaj miksaĵoj de kitosano/TPP/insulino kaj NP-oj senakvigitaj per diversaj metodoj.
Krome, ĉi tiuj rezultoj kongruas kun tiuj montritaj per SEM, kiuj montris, ke la enkapsuligitaj nanopartikloj restis sendifektaj kaj kiam ŝprucigitaj kaj frostigitaj per manitolo, sed en la foresto de manitolo, nur ŝprucsekigado produktis enkapsuligitajn partiklojn. Kontraste, la FTIR-ATR spektraj rezultoj de nanopartikloj frostigitaj sen manitolo estis tre similaj al la fizika miksaĵo de kitosano, TPP kaj insulino. Ĉi tiu rezulto indikas, ke la krucligoj inter kitosano, TPP kaj insulino jam ne ĉeestas en nanopartikloj frostigitaj sen manitolo. La strukturo de la nanopartikloj estis detruita dum frostigado sen krioprotektanto, kio videblas en la SEM-rezultoj (Fig. 2a). Surbaze de la morfologio kaj FTIR-rezultoj de dehidratigitaj insulinaj nanopartikloj, nur liofiligitaj, ŝprucsekigitaj kaj manitol-liberaj nanopartikloj estis uzitaj por rekonstruaj eksperimentoj kaj manitol-liberaj nanopartikloj pro la putriĝo de manitol-liberaj nanopartikloj dum dehidratiĝo. diskutu.
Dehidratiĝo estas uzata por longdaŭra stokado kaj reciklado en aliajn formulojn. La kapablo de sekaj nanopartikloj rekonstruiĝi post stokado estas kritika por ilia uzo en malsamaj formuloj kiel ekzemple tablojdoj kaj filmoj. Ni rimarkis, ke la averaĝa partikla grandeco de la ŝpruc-sekigitaj insulinaj nanopartikloj en la foresto de manitolo pliiĝis nur iomete post rekonstruo. Aliflanke, la partikla grandeco de la ŝpruc-sekigitaj kaj frostig-sekigitaj insulinaj nanopartikloj kun manitolo pliiĝis signife (Tabelo 1). PDI kaj EE ne ŝanĝiĝis signife (p > 0.05) post rekombinado de ĉiuj NP-oj en ĉi tiu studo (Tabelo 1). Ĉi tiu rezulto indikas, ke la plej multaj el la partikloj restis sendifektaj post redissolvo. Tamen, la aldono de manitolo rezultigis multe reduktitan insulinan ŝarĝon de liofiligitaj kaj ŝpruc-sekigitaj manitolaj nanopartikloj (Tabelo 1). Kontraste, la insulina ŝarĝenhavo de NP-oj ŝpruc-sekigitaj sen manitolo restis la sama kiel antaŭe (Tabelo 1).
Estas bone konate, ke la ŝarĝo de nanopartikloj estas kritika kiam uzataj por medikamentliveraj celoj. Por NP-oj kun malaltaj ŝarĝoj, tre grandaj kvantoj da materialo estas necesaj por atingi la terapian sojlon. Tamen, la alta viskozeco de tiaj altaj NP-koncentriĝoj kondukas al malkomforto kaj malfacilaĵo en buŝa administrado kaj injekteblaj formuloj, respektive 22. Krome, insulinaj NP-oj ankaŭ povas esti uzataj por fari tablojdojn kaj viskozajn biofilmojn 23, 24, kio postulas la uzon de grandaj kvantoj da NP-oj je malaltaj ŝarĝniveloj, rezultante en grandaj tablojdoj kaj dikaj biofilmoj, kiuj ne taŭgas por buŝaj aplikoj. Tial, dehidratigitaj NP-oj kun alta insulinŝarĝo estas tre dezirindaj. Niaj rezultoj sugestas, ke la alta insulinŝarĝo de manitol-liberaj ŝpruc-sekigitaj NP-oj povas oferti multajn allogajn avantaĝojn por ĉi tiuj alternativaj livermetodoj.
Ĉiuj senakvigitaj nanopartikloj estis konservitaj en fridujo dum tri monatoj. SEM-rezultoj montris, ke la morfologio de ĉiuj senakvigitaj nanopartikloj ne ŝanĝiĝis signife dum la tri-monata stokado (Fig. 4). Post rekonstruo en akvo, ĉiuj nanopartikloj montris iometan malpliiĝon de EE kaj liberigis proksimume malgrandan kvanton (~5%) da insulino dum la tri-monata stokado (Tabelo 2). Tamen, la averaĝa partikla grandeco de ĉiuj nanopartikloj pliiĝis. La partikla grandeco de nanopartikloj ŝprucsekigitaj sen manitolo pliiĝis al 525 nm, dum tiu de ŝprucsekigitaj kaj frostsekigitaj nanopartikloj kun manitolo pliiĝis al 872 kaj 921 nm, respektive (Tabelo 2).
Morfologio de diversaj senakvigitaj insulinaj nanopartikloj konservitaj dum tri monatoj: (a) SEM-bildo de liofiligitaj insulinaj nanopartikloj kun manitolo; (b) SEM-bildo de ŝprucsekigitaj insulinaj nanopartikloj sen manitolo; (c) sen manitolo SEM-bildoj de ŝprucsekigitaj insulinaj nanopartikloj.
Krome, precipitaĵoj estis viditaj en la rekonstruitaj insulinaj nanopartikloj, ŝpruc-sekigitaj per manitolo kaj frostig-sekigitaj (Fig. S2). Ĉi tio povas esti kaŭzita de grandaj partikloj, kiuj ne ĝuste suspendiĝas en la akvo. Ĉiuj ĉi-supraj rezultoj montras, ke la ŝpruc-sekiga tekniko povas protekti insulinajn nanopartiklojn kontraŭ dehidratiĝo kaj ke altaj ŝarĝoj de insulinaj nanopartikloj povas esti atingitaj sen iuj plenigaĵoj aŭ krioprotektantoj.
Insulinretenado estis testita en pH = 2.5 medio kun pepsino, tripsino, kaj α-kimotripsino por montri la protektan kapablon de nanopartikloj kontraŭ enzima digestado post dehidratiĝo. La insulinretenado de dehidratigitaj nanopartikloj estis komparita kun tiu de freŝe preparitaj nanopartikloj, kaj libera insulino estis uzata kiel negativa kontrolo. En ĉi tiu studo, libera insulino montris rapidan insulin-eliminon ene de 4 horoj en ĉiuj tri enzimaj traktadoj (Fig. 5a-c). Kontraste, insulin-elimintestado de nanopartikloj frostig-sekigitaj kun manitolo kaj nanopartikloj ŝpruc-sekigitaj kun aŭ sen manitolo montris signife pli altan protekton de ĉi tiuj nanopartikloj kontraŭ enzima digestado, kiu estis simila al tiu de freŝe preparitaj insulin-nanopartikloj (figuro 1).5a-c). Kun la helpo de nanopartikloj en pepsino, tripsino, kaj α-kimotripsino, pli ol 50%, 60%, kaj 75% de insulino povus esti protektitaj ene de 4 horoj, respektive (Fig. 5a-c). Ĉi tiu insulin-protekta... kapablo povas pliigi la ŝancon de pli alta insulinsorbo en la sangocirkuladon25. Ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke ŝprucsekigado kun aŭ sen manitolo kaj liofilizado kun manitolo povas konservi la insulin-protektan kapablon de NP-oj post dehidratiĝo.
Protekto kaj liberiga konduto de senakvigitaj insulinaj nanopartikloj: (a) protekto de insulino en pepsina solvaĵo; (b) protekto de insulino en tripsina solvaĵo; (c) protekto de insulino per α-kimotripsina solvaĵo; (d) La liberiga konduto de senakvigitaj NP-oj en pH = 2.5 solvaĵo; (e) la liberiga konduto de senakvigitaj NP-oj en pH = 6.6 solvaĵo; (f) la liberiga konduto de senakvigitaj NP-oj en pH = 7.0 solvaĵo.
Ĵus preparitaj kaj rekonstruitaj sekaj insulinaj nanopartikloj estis inkubaciitaj en diversaj bufroj (pH = 2.5, 6.6, 7.0) je 37 °C, simulante la pH-medion de la stomako, duodeno kaj supra maldika intesto, por ekzameni la efikon de insulino sur insulinrezisto. Liberiga konduto en malsamaj medioj. Fragmento de la gastrintesto. Ĉe pH = 2.5, insulin-ŝarĝitaj NP-oj kaj resolubligitaj sekaj insulinaj NP-oj montris komencan eksplodan liberigon ene de la unua horo, sekvata de malrapida liberigo dum la sekvaj 5 horoj (Fig. 5d). Ĉi tiu rapida liberigo komence estas plej verŝajne la rezulto de rapida surfaca desorbado de proteinmolekuloj, kiuj ne estas plene senmovigitaj en la interna strukturo de la partiklo. Ĉe pH = 6.5, insulin-ŝarĝitaj NP-oj kaj rekonstruitaj sekaj insulinaj NP-oj montris glatan kaj malrapidan liberigon dum 6 horoj, ĉar la pH de la testa solvaĵo estis simila al tiu de la NP-preparita solvaĵo (Fig. 5e). Ĉe pH = 7, la NP-oj estis malstabilaj kaj preskaŭ tute malkomponiĝis ene de la unuaj du horoj (Fig. 5f). Ĉi tio estas ĉar deprotonigo de kitosano okazas ĉe pli alta pH, kio rezultigas malpli kompaktan polimeran reton kaj liberigon de ŝarĝita insulino.
Krome, la insulinaj nanopartikloj ŝprucsekigitaj sen manitolo montris pli rapidan liberigan profilon ol la aliaj senakvigitaj nanopartikloj (Fig. 5d–f). Kiel antaŭe priskribite, la rekonstruitaj insulinaj nanopartikloj sekigitaj sen manitolo montris la plej malgrandan partiklan grandecon. Malgrandaj partikloj provizas pli grandan surfacareon, do plejparto de la koncerna medikamento estos ĉe aŭ proksime de la partikla surfaco, rezultante en rapida medikamentliberigo26.
La citotokseco de nanopartikloj estis esplorita per MTT-analizo. Kiel montrite en Figuro S4, ĉiuj senakvigitaj nanopartikloj montriĝis havi neniun signifan efikon sur ĉelan viveblecon je koncentriĝoj de 50–500 μg/ml, sugestante, ke ĉiuj senakvigitaj nanopartikloj povas esti sekure uzataj por atingi la terapian fenestron.
La hepato estas la ĉefa organo, tra kiu insulino plenumas siajn fiziologiajn funkciojn. HepG2-ĉeloj estas homa hepatoma ĉellinio ofte uzata kiel in vitro hepatocita asimila modelo. Ĉi tie, HepG2-ĉeloj estis uzitaj por taksi la ĉelan asimiladon de nanopartikloj senakvigitaj per liofilizado kaj ŝprucigado. Ĉela asimilado per konfokusa lasera skanado uzante fluocitometrion kaj vidkapablon post pluraj horoj da inkubacio kun libera FITC-insulino je koncentriĝo de 25 μg/mL, freŝe preparitaj FITC-insulin-ŝarĝitaj nanopartikloj kaj senakvigitaj FITC-insulin-ŝarĝitaj nanopartikloj je egalaj insulinkoncentriĝoj. Kvantaj mikroskopiaj (CLSM) observadoj estis faritaj. Liofiligitaj nanopartikloj sen manitolo estis detruitaj dum dehidratiĝo kaj ne estis taksitaj en ĉi tiu testo. La intraĉelaj fluoreskaj intensecoj de freŝe preparitaj insulin-ŝarĝitaj nanopartikloj, liofiligitaj nanopartikloj kun manitolo, kaj ŝprucigitaj nanopartikloj kun kaj sen manitolo (Fig. 6a) estis 4,3, 2,6, 2,4, kaj 4,1-oble pli altaj ol la liberaj. FITC-insulingrupo, respektive (Fig. 6b). Ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke enkapsuligita insulino estas pli potenca en ĉela sorbado ol libera insulino, ĉefe pro la pli malgranda grandeco de la insulin-ŝarĝitaj nanopartikloj produktitaj en la studo.
HepG2-ĉela sorbado post 4-hora inkubacio kun freŝe preparitaj NP-oj kaj senakvigitaj NP-oj: (a) Distribuo de FITC-insulina sorbado fare de HepG2-ĉeloj. (b) Geometria meznombro de fluoreskaj intensecoj analizitaj per fluocitometrio (n = 3), *P < 0,05 kompare kun libera insulino.
Simile, la CLSM-bildoj montris, ke la FITC-fluoreska intenseco de freŝe preparitaj FITC-insulin-ŝarĝitaj nanopartikloj kaj FITC-insulin-ŝarĝitaj ŝpruc-sekigitaj nanopartikloj (sen manitolo) estis multe pli fortaj ol tiuj de la aliaj specimenoj (Fig. 6a). Krome, kun la aldono de manitolo, la pli alta viskozeco de la solvaĵo pliigis la reziston al ĉela sorbado, rezultante en malpliiĝinta insulina proliferado. Ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke manitol-liberaj ŝpruc-sekigitaj nanopartikloj montris la plej altan ĉelan sorbadefikecon, ĉar ilia partikla grandeco estis pli malgranda ol tiu de frostig-sekigitaj nanopartikloj post re-dissolvo.
Kitosano (averaĝa molekula pezo 100 KDa, 75–85% deacetiligita) estis aĉetita de Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanado). Natria tripolifosfato (TPP) estis aĉetita de VWR (Radnor, Pensilvanio, Usono). Rekombinita homa insulino uzita en ĉi tiu studo estis de Fisher Scientific (Waltham, MA, Usono). Fluorescein-izotiocianato (FITC)-markita homa insulino kaj 4′,6-diamidino-2-fenilindola dihidroklorido (DAPI) estis aĉetitaj de Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanado). La HepG2-ĉellinio estis akirita de ATCC (Manassas, Virginio, Usono). Ĉiuj aliaj reakciiloj estis analizaj aŭ kromatografiaj.
Preparu 1 mg/ml CS-solvaĵon dissolvante ĝin en duoble distilita akvo (DD-akvo) enhavanta 0.1% acetatan acidon. Preparu 1 mg/ml solvaĵojn de TPP kaj insulino dissolvante ilin en DD-akvo kaj 0.1% aceta acido, respektive. La antaŭ-emulsio estis preparita per polytron PCU-2-110 alt-rapida homogenizilo (Brinkmann Ind. Westbury, NY, Usono). La preparprocezo estas jena: unue, 2 ml da TPP-solvaĵo estas aldonitaj al 4 ml da insulina solvaĵo, kaj la miksaĵo estas kirlata dum 30 minutoj kaj plene miksita. Poste, la miksita solvaĵo estis aldonita gute al la CS-solvaĵo per injektilo sub alt-rapida kirlado (10,000 rpm). La miksaĵoj estis tenataj sub alt-rapida kirlado (15,000 rpm) en glacibano dum 30 minutoj, kaj ili estis alĝustigitaj al certa pH por akiri krucligitajn insulinajn NP-ojn. Por plue homogenigi kaj redukti la partiklan grandecon de insulinaj NP-oj, ili estis sonigitaj por pliajn 30 minutojn en glacibano uzante sondilon (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germanio).
Insulinaj NPS estis testitaj pri Z-averaĝa diametro, polidispersa indekso (PDI) kaj zeta-potencialo uzante dinamikajn lumdisĵetajn (DLS) mezuradojn uzante Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Aŭstrio) diluante ilin en DD-akvo je 25°C. Morfologio kaj grandecdistribuo estis karakterizitaj per Hitachi H7600 transmisia elektrona mikroskopo (TEM) (Hitachi, Tokio, Japanio), kaj bildoj poste estis analizitaj uzante Hitachi-bildigan programaron (Hitachi, Tokio, Japanio). Por taksi la enkapsuligan efikecon (EE) kaj ŝarĝkapaciton (LC) de insulinaj NP-oj, la NP-oj estis pipeteitaj en ultrafiltrajn tubojn kun molekulpeza limo de 100 kDa kaj centrifugitaj je 500 xg dum 30 minutoj. Neenkapsuligita insulino en la filtraĵo estis kvantigita uzante Agilent 1100 Series HPLC-sistemon (Agilent, Santa Clara, Kalifornio, Usono) konsistantan el kvaternara pumpilo, aŭtomata specimenilo, kolumna hejtilo, kaj DAD-detektilo. Insulino estis analizita per C18-kolumno (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, Usono) kaj detektita je 214 nm. La movebla fazo estis acetonitrilo kaj akvo, enhavanta 0,1% TFA, gradientajn proporciojn de 10/90 ĝis 100/0, kaj funkciis dum 10 minutoj. La movebla fazo estis pumpita je flukvanto de 1,0 ml/min. La kolumna temperaturo estis agordita al 20 °C. Kalkulu la procentojn de EE kaj LC uzante la ekvaciojn (1) kaj (2).
Diversaj proporcioj CS/insulino intervalantaj de 2.0 ĝis 4.0 estis testitaj por optimumigi insulinajn NP-ojn. Malsamaj kvantoj de CS-solvaĵo estis aldonitaj dum la preparado, dum la insulino/TPP-miksaĵo estis konservita konstanta. Insulinaj NP-oj estis preparitaj en la pH-intervalo de 4.0 ĝis 6.5 per zorgema kontrolado de la pH de la miksaĵo post aldono de ĉiuj solvaĵoj (insulino, TPP kaj CS). La EE kaj partikla grandeco de insulinaj nanopartikloj estis taksitaj ĉe malsamaj pH-valoroj kaj CS/insulinaj masaj proporcioj por optimumigi la formadon de insulinaj NP-oj.
La optimumigitaj insulinaj nanopartikloj estis metitaj sur la aluminian ujon kaj kovritaj per papertuko streĉita per iom da glubendo. Poste, la ŝraŭbitaj ujoj estis metitaj en Labconco FreeZone-liostigsekigilon (Labconco, Kansasurbo, Misurio, Usono) ekipitan per pletsekigilo. La temperaturo kaj vakua premo estis agorditaj je -10 °C, 0.350 Torr dum la unuaj 2 horoj, kaj 0 °C kaj 0.120 Torr dum la ceteraj 22 horoj de la 24 horoj por akiri sekajn insulinajn nanopartiklojn.
Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Svislando) estis uzata por generi enkapsuligitan insulinon. La elektitaj sekigparametroj estis: temperaturo 100 °C, nutrofluo 3 L/min, kaj gasfluo 4 L/min.
Insulinaj nanopartikloj antaŭ kaj post dehidratiĝo estis karakterizitaj per FTIR-ATR-spektroskopio. Dehidratigitaj nanopartikloj same kiel libera insulino kaj kitosano estis analizitaj per Spectrum 100 FTIR-spektrofotometro (PerkinElmer, Waltham, Masaĉuseco, Usono) ekipita per universala ATR-prova akcesoraĵo (PerkinElmer, Waltham, Masaĉuseco, Usono). Signalaj averaĝoj estis akiritaj de 16 skanadoj je rezolucio de 4 cm² en la frekvenca gamo de 4000-600 cm².
Morfologio de sekaj insulinaj nanopartikloj estis taksita per SEM-bildoj de frostig-sekigitaj kaj ŝpruc-sekigitaj insulinaj nanopartikloj kaptitaj per Helios NanoLab 650 Fokusita Jona Fasko-Skananta Elektrona Mikroskopo (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregono, Usono). La ĉefa uzita parametro estis tensio 5 keV kaj kurento 30 mA.
Ĉiuj dehidratigitaj insulinaj nanopartikloj estis redissolvitaj en disigita akvo. Partikla grandeco, PDI, EE kaj LC estis denove testitaj uzante la saman metodon menciitan antaŭe por taksi ilian kvaliton post dehidratiĝo. La stabileco de anhidroinsulinaj nanopartikloj ankaŭ estis mezurita per testado de la ecoj de la nanopartikloj post longedaŭra stokado. En ĉi tiu studo, ĉiuj nanopartikloj post dehidratiĝo estis stokitaj en fridujo dum tri monatoj. Post tri monatoj da stokado, nanopartikloj estis testitaj pri morfologia partikla grandeco, PDI, EE kaj LC.
Dissolvu 5 mL da rekonstruitaj nanopartikloj en 45 mL enhavantaj simulitan stomakan fluidon (pH 1.2, enhavanta 1% da pepsino), intestan fluidon (pH 6.8, enhavanta 1% da tripsino) aŭ kimotripsinan solvaĵon (100 g/mL, en fosfata bufro, pH 7.8) por taksi la efikecon de insulino en protektado de nanopartikloj post dehidratiĝo. Ili estis inkubaciitaj je 37°C kun skurapideco de 100 rpm. 500 μL da la solvaĵo estis kolektitaj je malsamaj tempopunktoj kaj la insulinkoncentriĝo estis determinita per HPLC.
La in vitro liberiga konduto de freŝe preparitaj kaj senakvigitaj insulinaj nanopartikloj estis testita per la dializa saka metodo (molekulpeza limo 100 kDa, Spectra Por Inc.). Freŝe preparitaj kaj rekonstruitaj sekaj NP-oj estis dialigitaj en fluidoj je pH 2.5, pH 6.6, kaj pH 7.0 (0.1 M fosfat-bufrita salakvo, PBS) por simuli la pH-medion de la stomako, duodeno, kaj supra maldika intesto, respektive. Ĉiuj specimenoj estis inkubaciitaj je 37 °C kun kontinua skuado je 200 rpm. Aspiru la fluidon ekster la 5 mL dializa sako je la jenaj tempoj: 0.5, 1, 2, 3, 4, kaj 6 h, kaj tuj replenigu la volumenon per freŝa dializaĵo. Insulinpoluado en la fluido estis analizita per HPLC, kaj la rapideco de insulinliberigo el la nanopartikloj estis kalkulita el la proporcio de libera insulino liberigita al totala insulino enkapsuligita en la nanopartikloj (Ekvacio 3).
Homaj hepatocelulaj karcinomaj ĉellinioj HepG2 estis kultivitaj en 60 mm diametraj pladoj uzante Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) enhavantan 10% fetan bovan serumon, 100 IU/mL penicilinon, kaj 100 μg/mL streptomicinon29. Kulturoj estis konservitaj je 37°C, 95% relativa humideco, kaj 5% CO2. Por sorbado-analizoj, HepG2-ĉeloj estis semitaj je 1 × 10⁵ ĉeloj/ml sur 8-puta Nunc Lab-Tek kamera glitsistemo (Thermo Fisher, NY, Usono). Por citotoksecaj analizoj, ili estis semitaj en 96-putajn platojn (Corning, NY, Usono) je denseco de 5 × 10⁴ ĉeloj/ml.
La MTT-analizo estis uzata por taksi la citotoksecon de freŝe preparitaj kaj senakvigitaj insulinaj NP-oj30. HepG2-ĉeloj estis semitaj en 96-putaj platoj je denseco de 5 × 10⁴ ĉeloj/mL kaj kultivitaj dum 7 tagoj antaŭ la testado. Insulinaj NP-oj estis diluitaj al diversaj koncentriĝoj (50 ĝis 500 μg/mL) en kulturmedio kaj poste administritaj al ĉeloj. Post 24 horoj da inkubacio, la ĉeloj estis lavitaj 3 fojojn per PBS kaj inkubaciitaj kun medio enhavanta 0.5 mg/ml MTT dum pliaj 4 horoj. Citotokseco estis taksita per mezurado de la enzima redukto de flava tetrazolia MTT al purpura formazano je 570 nm uzante Tecan infinite M200 pro spektrofotometran platlegilon (Tecan, Männedorf, Svislando).
La ĉela asimila efikeco de NP-oj estis testita per konfokusa lasera skanada mikroskopio kaj fluocitometria analizo. Ĉiu puto de la kamera glitsistemo Nunc Lab-Tek estis traktita per libera FITC-insulino, FITC-insulino-ŝarĝitaj NP-oj, kaj rekonstruita per 25 μg/mL da senakvigitaj FITC-insulino NP-oj je la sama koncentriĝo kaj inkubita dum 4 horoj. Ĉeloj estis lavitaj 3 fojojn per PBS kaj fiksitaj per 4% paraformaldehido. Nukleoj estis koloritaj per 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Insulinlokigo estis observita per lasera skanado/du-fotona konfokusa mikroskopo Olympus FV1000 (Olympus, Ŝinĝuku-urbo, Tokio, Japanio). Por fluocitometria analizo, la samaj koncentriĝoj de 10 μg/mL libera FITC-insulino, FITC-insulino-ŝarĝitaj NP-oj, kaj resolubiligitaj senakvigitaj FITC-insulino NP-oj estis aldonitaj al... 96-putaj platoj semitaj per HepG2-ĉeloj kaj inkubaciitaj dum 4 horoj. Post 4 horoj da inkubacio, la ĉeloj estis forigitaj kaj lavitaj 3 fojojn per FBS. 5 × 10⁴ ĉeloj por specimeno estis analizitaj per BD LSR II fluocitometro (BD, Franklin Lakes, Nov-Ĵerzejo, Usono).
Ĉiuj valoroj estas esprimitaj kiel meznombro ± norma devio. Komparoj inter ĉiuj grupoj estis taksitaj per unudirekta ANOVA aŭ t-testo fare de IBM SPSS Statistics 26 por Mac (IBM, Endicott, Novjorko, Usono) kaj p < 0,05 estis konsiderata statistike signifa.
Ĉi tiu studo montras la flekseblecon kaj kapablon de ŝprucsekigado por senakvigi krucligitajn kitosan/TPP/insulinnanopartiklojn kun pli bona rekonstruo kompare kun normaj liofil-sekigmetodoj uzantaj volumigajn agentojn aŭ krioprotektantojn, kun pli alta ŝarĝkapacito kaj pli alta ŝarĝkapacito. La optimumigitaj insulinnanopartikloj rezultigis averaĝan partiklograndecon de 318 nm kaj enkapsuligan efikecon de 99.4%. SEM kaj FTIR-rezultoj post senakvigo montris, ke la sfera strukturo estis konservita nur en ŝprucsekigitaj nanopartikloj kun kaj sen manitolo kaj liofiligitaj kun manitolo, sed liofiligitaj nanopartikloj sen manitolo estis malkomponitaj dum senakvigo. En la testo pri rekonstrua kapablo, insulinnanopartikloj ŝprucsekigitaj sen manitolo montris la plej malgrandan averaĝan partiklograndecon kaj la plej altan ŝarĝon post rekonstruo. La liberigaj kondutoj de ĉiuj ĉi tiuj senakvigitaj nanopartikloj montris, ke ili estis rapide liberigitaj en solvaĵoj de pH = 2.5 kaj pH = 7, kaj tre stabilaj en solvaĵo de pH = 6.5. Kompare kun aliaj redissolvitaj senakvigitaj nanopartikloj, la nanopartikloj... ŝprucsekigita sen manitolo montris la plej rapidan liberigon. Ĉi tiu rezulto kongruas kun tio observita en la ĉela asimila analizo, ĉar ŝprucsekigitaj nanopartikloj en la foresto de manitolo preskaŭ tute konservis la ĉelan asimilan efikecon de ĵus preparitaj nanopartikloj. Ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke sekaj insulinnanopartikloj preparitaj per senmanitola ŝprucsekigado estas plej taŭgaj por plia prilaborado en aliajn anhidrajn dozajn formojn, kiel ekzemple buŝajn tablojdojn aŭ biogluajn filmojn.
Pro problemoj pri intelekta propraĵo, la datumbazoj generitaj kaj/aŭ analizitaj dum la nuna studo ne estas publike haveblaj, sed estas haveblaj de la respektivaj aŭtoroj laŭ racia peto.
Kagan, A. Tipo 2 diabeto: sociaj kaj sciencaj originoj, medicinaj komplikaĵoj, kaj implicoj por pacientoj kaj aliaj. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. La disvolviĝo de insulina enkapsuligo: ĉu parola administrado nun eblas? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Lastatempaj progresoj en buŝaj insulin-ŝarĝitaj liposomaj liverosistemoj por la traktado de diabeto. Interpretado. J. Apoteko. 549, 201–217 (2018).