La artikolo estas parto de la esplortemo "Plibonigi la reziston de guŝoj al patogenoj kaj damaĝbestoj", vidu ĉiujn 5 artikolojn
La kaŭza agento de la funga plantmalsana nekrozo *Sclerotinia sclerotiorum* (Lib.) de Bary uzas plurtavolan strategion por infekti malsamajn gastigajn plantojn. Ĉi tiu studo proponas la uzon de la diamino L-ornitino, ne-proteina aminoacido kiu stimulas la sintezon de aliaj esencaj aminoacidoj, kiel alternativan administradstrategion por plifortigi la molekulajn, fiziologiajn kaj biokemiajn respondojn de Phaseolus vulgaris L. al blanka ŝimo kaŭzita de *Pseudomonas sclerotiorum*. In vitro eksperimentoj montris, ke L-ornitino signife inhibis la micelian kreskon de *S. pyrenoidosa* laŭ doz-dependa maniero. Krome, ĝi povus signife redukti la severecon de blanka ŝimo sub forcejaj kondiĉoj. Plue, L-ornitino stimulis la kreskon de la traktitaj plantoj, indikante, ke la testitaj koncentriĝoj de L-ornitino ne estis fitotoksaj por la traktitaj plantoj. Krome, L-ornitino plifortigis la esprimon de ne-enzimaj antioksidantoj (totalaj solveblaj fenoloj kaj flavonoidoj) kaj enzimaj antioksidantoj (katalazo (CAT), peroksidazo (POX) kaj polifenola oksidazo (PPO)), kaj pliigis la esprimon de tri antioksidant-rilataj genoj (PvCAT1, PvSOD kaj PvGR). Plue, *in silico* analizo rivelis la ĉeeston de supozebla oksaloacetata acetilhidrolaza (SsOAH) proteino en la *S. sclerotiorum* genaro, kiu estis tre simila al la oksaloacetata acetilhidrolazaj (SsOAH) proteinoj de *Aspergillus fijiensis* (AfOAH) kaj *Penicillium* sp. (PlOAH) rilate al funkcia analizo, konservitaj domajnoj kaj topologio. Interese, la aldono de L-ornitino al terpoma dekstroza buljono (PDB) medio signife malpliigis la esprimon de la SsOAH-geno en *S. sclerotiorum* micelioj. Simile, eksogena apliko de L-ornitino signife malpliigis la esprimon de la SsOAH-geno en fungaj micelioj kolektitaj de traktitaj plantoj. Fine, apliko de L-ornitino signife malpliigis la sekrecion de oksalacido kaj en la PDB-medio kaj en la infektitaj folioj. Konklude, L-ornitino ludas ŝlosilan rolon en la konservado de la redoksa stato kaj ankaŭ en plibonigado de la defendrespondo de infektitaj plantoj. La rezultoj de ĉi tiu studo povas helpi en la disvolviĝo de novigaj, ekologie amikajn metodojn por kontroli blankan ŝimon kaj mildigi ĝian efikon sur fabproduktado kaj aliaj kultivaĵoj.
Blanka ŝimo, kaŭzita de la nekrotrofa fungo Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, estas detruiga, rendiment-reduktanta malsano, kiu prezentas gravan minacon al tutmonda produktado de fazeoloj (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum estas unu el la plej malfacile kontroleblaj grund-portitaj fungaj plantpatogenoj, kun larĝa gastiga gamo de pli ol 600 plantspecioj kaj la kapablo rapide mergmoligi gastigajn histojn laŭ nespecifa maniero (Liang kaj Rollins, 2018). Sub malfavoraj kondiĉoj, ĝi spertas kritikan fazon de sia vivciklo, restante dormanta dum longaj periodoj kiel nigraj, malmolaj, sem-similaj strukturoj nomitaj 'sklerotoj' en la grundo aŭ kiel blankaj, lanugaj kreskaĵoj en la micelio aŭ tigomedolo de infektitaj plantoj (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum kapablas formi sklerotojn, kio permesas al ĝi postvivi en infektitaj kampoj dum longaj periodoj kaj persisti dum malsano (Schwartz et al., 2005). Sklerotoj estas riĉaj je nutraĵoj, povas persisti en la grundo dum longaj periodoj, kaj servas kiel la ĉefa inokulo por postaj infektoj (Schwartz et al., 2005). Sub favoraj kondiĉoj, sklerotoj ĝermas kaj produktas aerajn sporojn, kiuj povas infekti ĉiujn superterajn partojn de la planto, inkluzive de sed ne limigite al floroj, tigoj aŭ guŝoj (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum uzas plurtavolan strategion por infekti siajn gastigajn plantojn, implikante serion da kunordigitaj eventoj de sklerota ĝermado ĝis simptoma evoluo. Komence, S. sclerotiorum produktas ŝvebajn sporojn (nomitajn askosporoj) el fungosimilaj strukturoj nomataj apotecioj, kiuj fariĝas aeraj kaj evoluas en nemotilajn sklerotojn sur infektitaj plantrestaĵoj (Bolton et al., 2006). La fungo tiam sekrecias oksalatan acidon, virulencan faktoron, por kontroli la pH de la plantĉelmuro, antaŭenigi enziman degeneron kaj histinvadon (Hegedus kaj Rimmer, 2005), kaj subpremi la oksidativan eksplodon de la gastiga planto. Ĉi tiu acidiĝa procezo malfortigas la plantĉelmuron, provizante favoran medion por la normala kaj efika funkciado de fungaj ĉelmur-degradaj enzimoj (CWDEoj), permesante al la patogeno superi la fizikan baron kaj penetri la gastigajn histojn (Marciano et al., 1983). Post penetro, S. sclerotiorum sekrecias kelkajn CWDE-ojn, kiel ekzemple poligalakturonazon kaj celulazon, kiuj faciligas ĝian disvastiĝon en infektitaj histoj kaj kaŭzas histan nekrozon. La progresado de lezoj kaj hifaj matoj kondukas al la karakterizaj simptomoj de blanka ŝimo (Hegedus kaj Rimmer, 2005). Dume, gastigaj plantoj rekonas patogen-asociitajn molekulajn ŝablonojn (PAMP-oj) per padronrekonaj receptoroj (PRR-oj), ekigante serion de signalaj eventoj, kiuj finfine aktivigas defendrespondojn.
Malgraŭ jardekoj da klopodoj por kontroli malsanojn, mankoj de adekvata rezistema ĝermo-plasmo restas en fazeoloj, kiel en aliaj komercaj kultivaĵoj, pro la rezisto, supervivo kaj adaptiĝkapablo de la patogeno. Malsanadministrado estas tial ekstreme malfacila kaj postulas integran, multfacetan strategion, kiu inkluzivas kombinaĵon de kulturaj praktikoj, biologia kontrolo kaj kemiaj fungicidoj (O'Sullivan et al., 2021). Kemia kontrolo de blanka ŝimo estas la plej efika, ĉar fungicidoj, kiam aplikitaj ĝuste kaj en la ĝusta tempo, povas efike kontroli la disvastiĝon de la malsano, redukti la severecon de infekto kaj minimumigi rikoltperdojn. Tamen, trouzo kaj troa dependeco de fungicidoj povas konduki al la apero de rezistemaj trostreĉoj de S. sclerotiorum kaj negative influi necelajn organismojn, grundsanon kaj akvokvaliton (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Tial, trovi ekologie amikajn alternativojn fariĝis ĉefa prioritato.
Poliaminoj (PA-oj), kiel putrescino, spermidino, spermino kaj kadaverino, povas servi kiel esperigaj alternativoj kontraŭ grund-portitaj plantpatogenoj, tiel tute aŭ parte reduktante la uzon de danĝeraj kemiaj fungicidoj (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Ĉe pli altaj plantoj, PA-oj partoprenas en multaj fiziologiaj procezoj, inkluzive de, sed ne limigite al, ĉeldividiĝo, diferenciĝo kaj respondo al abiotaj kaj biotaj stresoj (Killiny kaj Nehela, 2020). Ili povas agi kiel antioksidantoj, helpi forigi reaktivajn oksigenajn speciojn (ROS), konservi redoksan homeostazon (Nehela kaj Killiny, 2023), indukti defend-rilatajn genojn (Romero et al., 2018), reguligi diversajn metabolajn vojojn (Nehela kaj Killiny, 2023), moduli endogenajn fitohormonojn (Nehela kaj Killiny, 2019), establi ĉiean akiritan reziston (SAR), kaj reguligi planto-patogenajn interagojn (Nehela kaj Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Indas rimarki, ke la specifaj mekanismoj kaj roloj de PA-oj en planta defendo varias depende de plantspecioj, patogenoj kaj mediaj kondiĉoj. La plej abunda PA en plantoj estas biosintezita el la esenca poliamino L-ornitino (Killiny kaj Nehela, 2020).
L-ornitino ludas plurajn rolojn en plantkresko kaj disvolviĝo. Ekzemple, antaŭaj studoj montris, ke en rizo (Oryza sativa), ornitino povas esti asociita kun nitrogena reciklado (Liu et al., 2018), rizrendimento, kvalito kaj aromo (Lu et al., 2020), kaj respondo al akvostreso (Yang et al., 2000). Krome, ekstera apliko de L-ornitino signife plibonigis sekecleletivecon en sukerbeto (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) kaj mildigis salstreson en cepo (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu kaj Çavuşoǧlu, 2021) kaj akaĵuo (Anacardium occidentale) plantoj (da Rocha et al., 2012). La ebla rolo de L-ornitino en defendo kontraŭ abiota streso povas ŝuldiĝi al ĝia implikiĝo en prolinamasiĝo en traktitaj plantoj. Ekzemple, genoj rilataj al prolina metabolo, kiel ekzemple ornitina delta aminotransferazo (delta-OAT) kaj prolina dehidrogenazo (ProDH1 kaj ProDH2) genoj, antaŭe estis raportitaj kiel implikitaj en la defendo de Nicotiana benthamiana kaj Arabidopsis thaliana kontraŭ ne-gastigaj Pseudomonas syringae trostreĉoj (Senthil-Kumar kaj Mysore, 2012). Aliflanke, funga ornitina dekarboksilazo (ODC) estas necesa por patogena kresko (Singh et al., 2020). Celado de ODC de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici per gastiganto-induktita gena silentigo (HIGS) signife plifortigis la reziston de tomatoplantoj al Fusarium-velko (Singh et al., 2020). Tamen, la ebla rolo de eksogena ornitina apliko kontraŭ biotaj stresoj kiel fitopatogenoj ne estis bone studita. Pli grave, la efikoj de ornitino sur malsanrezisto kaj la rilataj biokemiaj kaj fiziologiaj fenomenoj restas plejparte neesploritaj.
Kompreni la kompleksecon de S. sclerotiorum-infekto de guŝoj estas grava por la disvolviĝo de efikaj kontrolstrategioj. En ĉi tiu studo, ni celis identigi la eblan rolon de la diamino L-ornitino kiel ŝlosila faktoro en plifortigo de la defendmekanismoj kaj rezisto de guŝoplantoj al Sclerotinia sclerotiorum-infekto. Ni hipotezas, ke, krom plifortigi la defendrespondojn de infektitaj plantoj, L-ornitino ankaŭ ludas ŝlosilan rolon en konservado de la redoksan staton. Ni proponas, ke la eblaj efikoj de L-ornitino rilatas al la reguligo de enzimaj kaj neenzimaj antioksidaj defendmekanismoj kaj interfero kun fungaj patogenecaj/virulencaj faktoroj kaj asociitaj proteinoj. Ĉi tiu duobla funkcieco de L-ornitino igas ĝin promesplena kandidato por daŭripova strategio por mildigi la efikon de blanka ŝimo kaj plifortigi la reziston de ordinaraj guŝokultivaĵoj al ĉi tiu potenca funga patogeno. La rezultoj de la nuna studo povas helpi en la disvolviĝo de novigaj, ekologie amikaj metodoj por kontroli blankan ŝimon kaj mildigi ĝian efikon sur guŝoproduktado.
En ĉi tiu studo, sentema komerca variaĵo de ordinara fazeolo, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), estis uzata kiel eksperimenta materialo. Sanajn semojn afable provizis la Fako pri Esploro de Guŝoj, Instituto pri Esploro de Kampaj Kultivaĵoj (FCRI), Centro pri Agrikultura Esplorsistemo (ARC), Egiptujo. Kvin semoj estis semitaj en plastaj potoj (interna diametro 35 cm, profundo 50 cm) plenigitaj per grundo infektita de S. sclerotiorum sub forcejaj kondiĉoj (25 ± 2 °C, relativa humideco 75 ± 1%, 8 horoj da lumo/16 horoj da mallumo). 7-10 tagojn post semado (DPS), la plantidoj estis maldensigitaj por lasi nur du plantidojn kun unuforma kresko kaj tri plene kreskintaj folioj en ĉiu poto. Ĉiuj potumitaj plantoj estis akvumitaj unufoje ĉiujn du semajnojn kaj sterkitaj ĉiumonate laŭ la rekomendita kvanto por la koncerna variaĵo.
Por prepari koncentriĝon de 500 mg/L da L-ornitinodiamino (ankaŭ konata kiel (+)-(S)-2,5-diaminopentanoata acido; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germanio), 50 mg unue estis dissolvitaj en 100 mL da sterila distilita akvo. La baza solvaĵo poste estis diluita kaj uzita en postaj eksperimentoj. Mallonge, ses serioj de L-ornitinaj koncentriĝoj (12,5, 25, 50, 75, 100 kaj 125 mg/L) estis testitaj in vitro. Krome, sterila distilita akvo estis uzita kiel negativa kontrolo (Mock) kaj komerca fungicido "Rizolex-T" 50% malsekigebla pulvoro (toklofos-metilo 20% + tiramo 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Gubernio, Egiptujo) estis uzita kiel pozitiva kontrolo. Komerca fungicido "Rizolex-T" estis testita in vitro je kvin koncentriĝoj (2, 4, 6, 8 kaj 10 mg/L).
Specimenoj de ordinaraj fazeolaj tigoj kaj guŝoj montrantaj tipajn simptomojn de blanka ŝimo (infestiĝofteco: 10–30%) estis kolektitaj de komercaj bienoj. Kvankam la plej multaj el la infektitaj plantmaterialoj estis identigitaj laŭ specio/vario (sentema komerca vario Giza 3), aliaj, precipe tiuj akiritaj de lokaj merkatoj, estis de nekonataj specioj. La kolektitaj infektitaj materialoj unue estis surfaco-desinfektitaj per 0.5% natria hipoklorita solvaĵo dum 3 minutoj, poste ellavitaj plurfoje per sterila distilita akvo kaj viŝitaj sekigitaj per sterila filtrilpapero por forigi troan akvon. La infektitaj organoj poste estis tranĉitaj en malgrandajn pecojn de la meza histo (inter sanaj kaj infektitaj histoj), kultivitaj sur terpoma dekstroza agaragaro (PDA) medio kaj kovitaj je 25 ± 2 °C kun 12-hora lumo/12-hora malluma ciklo dum 5 tagoj por stimuli sklerotojn. La micela pintometodo ankaŭ estis uzata por purigi fungajn izolitaĵojn de miksitaj aŭ poluitaj kulturoj. La purigita funga izolitaĵo unue estis identigita surbaze de siaj kulturaj morfologiaj karakterizaĵoj kaj poste konfirmita kiel S. sclerotiorum surbaze de mikroskopaj trajtoj. Fine, ĉiuj purigitaj izolitaĵoj estis testitaj pri patogeneco sur la sentema ordinara fazeola kulturvario Giza 3 por plenumi la postulatojn de Koch.
Krome, la plej enpenetra izolitaĵo de S. sclerotiorum (izolitaĵo n-ro 3) estis plue konfirmita surbaze de interna transskribita interaĵo (ITS) sekvencado kiel priskribite de White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Mallonge, la izolitaĵoj estis kultivitaj en terpoma dekstroza buljono (PDB) kaj inkubaciitaj je 25 ± 2 °C dum 5-7 tagoj. Funga micelio estis poste kolektita, filtrita tra fromaĝtuko, lavita dufoje per sterila akvo, kaj sekigita per sterila filtrilpapero. Genara DNA estis izolita uzante la Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). La ITS rDNA-regiono estis poste amplifikita uzante la specifan prajmerparon ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; atendata grandeco: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). La purigitaj PCR-produktoj estis senditaj por sekvencado (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). La ITS rDNA-sekvencoj estis sekvencitaj dudirekte uzante la Sanger-sekvencan metodon. La kunmetitaj serĉsekvencoj estis poste komparitaj kun la plej novaj datumoj en GenBank kaj la Nacia Centro por Bioteknologiaj Informoj (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) uzante BLASTn-programaron. La serĉsekvenco estis komparita kun 20 aliaj S. sclerotiorum-trostreĉoj/izolataĵoj prenitaj el la plej novaj datumoj en NCBI GenBank (Aldona Tabelo S1) uzante ClustalW en la Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; versio 11) (Kumar et al., 2024). Evolua analizo estis farita uzante la metodon de maksimuma verŝajneco kaj la ĝeneralan temp-inverteblan nukleotidan anstataŭigan modelon (Nei kaj Kumar, 2000). La arbo kun la plej alta logaritma verŝajneco estas montrita. La komenca arbo por la heŭristika serĉo estas elektita elektante la arbon kun la pli alta logaritma verŝajneco inter la najbaro-kuniga (NJ) arbo (Kumar et al., 2024) kaj la maksimuma ŝparemo (MP) arbo. La NJ-arbo estis konstruita uzante paran distancmatricon kalkulitan uzante la ĝeneralan temp-inverteblan modelon (Nei kaj Kumar, 2000).
La kontraŭbakteria aktiveco de L-ornitino kaj la baktericido "Rizolex-T" estis determinita in vitro per la agar-difuza metodo. Metodo: Prenu la taŭgan kvanton de la baza solvaĵo de L-ornitino (500 mg/L) kaj miksu ĝin plene kun 10 ml da la PDA-nutra medio por prepari solvaĵojn kun finaj koncentriĝoj de 12,5, 25, 50, 75, 100 kaj 125 mg/L, respektive. Kvin koncentriĝoj de la fungicido "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 kaj 10 mg/L) kaj sterila distilita akvo estis uzitaj kiel kontrolo. Post kiam la medio solidiĝis, freŝe preparita micela ŝtopilo de Sclerotinia sclerotiorum-kulturo, 4 mm en diametro, estis translokigita al la centro de la Petri-plado kaj kultivita je 25±2°C ĝis la micelio kovris la tutan kontrolan Petri-pladon, post kio la funga kresko estis registrita. Kalkulu la procentan inhibicion de radia kresko de S. sclerotiorum uzante ekvacion 1:
La eksperimento estis ripetata dufoje, kun ses biologiaj ripetoj por ĉiu kontrolgrupo/eksperimenta grupo kaj kvin potoj (du plantoj po poto) por ĉiu biologia ripeto. Ĉiu biologia ripeto estis analizita dufoje (du teknikaj ripetoj) por certigi la precizecon, fidindecon kaj reprodukteblecon de la eksperimentaj rezultoj. Krome, probita regresa analizo estis uzata por kalkuli la duonmaksimuman inhibician koncentriĝon (IC50) kaj IC99 (Prentice, 1976).
Por taksi la potencialon de L-ornitino sub forcejaj kondiĉoj, du sinsekvaj poteksperimentoj estis faritaj. Mallonge, la potoj estis plenigitaj per steriligita argil-sabla grundo (3:1) kaj inokulitaj per freŝe preparita kulturo de S. sclerotiorum. Unue, la plej enpenetra izolitaĵo de S. sclerotiorum (izolitaĵo n-ro 3) estis kultivita per duonigado de unu sklerocio, metado de ĝi vizaĝmalsupren sur PDA kaj kovado je 25°C en konstanta mallumo (24 h) dum 4 tagoj por stimuli micelan kreskon. Kvar 5 mm diametraj agaragarŝtopiloj estis poste prenitaj de la antaŭa rando kaj inokulitaj per 100 g da sterila miksaĵo de tritiko kaj rizbrano (1:1, v/v) kaj ĉiuj flakonoj estis kovitaj je 25 ± 2 °C sub 12-hora lumo/12-hora mallumociklo dum 5 tagoj por stimuli sklerotian formadon. La enhavo de ĉiuj flakonoj estis plene miksita por certigi homogenecon antaŭ ol aldoni grundon. Poste, 100 g da la koloniiga brana miksaĵo estis aldonita al ĉiu poto por certigi konstantan koncentriĝon de patogenoj. La inokulitaj potoj estis akvumitaj por aktivigi fungan kreskon kaj metitaj en forcejajn kondiĉojn dum 7 tagoj.
Kvin semoj de la variaĵo Giza 3 estis poste semitaj en ĉiun poton. Por la potoj traktitaj per L-ornitino kaj la fungicido Rizolex-T, la steriligitaj semoj unue estis trempitaj dum du horoj en akva solvaĵo de la du komponaĵoj kun fina IC99-koncentriĝo de ĉirkaŭ 250 mg/L kaj 50 mg/L, respektive, kaj poste aersekigitaj dum unu horo antaŭ semado. Aliflanke, la semoj estis trempitaj en sterila distilita akvo kiel negativa kontrolo. Post 10 tagoj, antaŭ la unua akvumado, la plantidoj estis maldensigitaj, lasante nur du purajn plantidojn en ĉiu poto. Plie, por certigi infekton per S. sclerotiorum, fazeolaj tigoj en la sama evolua stadio (10 tagoj) estis tranĉitaj ĉe du malsamaj lokoj uzante steriligitan skalpelon kaj ĉirkaŭ 0.5 g da la koloniiga brana miksaĵo estis metita en ĉiun vundon, sekvata de alta humideco por stimuli infekton kaj malsanevoluon en ĉiuj inokulitaj plantoj. Kontrolplantoj estis simile vunditaj kaj egala kvanto (0.5 g) da sterila, nekoloniigita brana miksaĵo estis metita en la vundon kaj konservita sub alta humideco por simuli la medion por malsanevoluo kaj certigi konsistencon inter la traktadgrupoj.
Traktado: Fazeolaj plantidoj estis akvumitaj per 500 ml da akva solvaĵo de L-ornitino (250 mg/l) aŭ la fungicido Rizolex-T (50 mg/l) per irigacio de la grundo, poste la traktado estis ripetata tri fojojn je intervaloj de 10 tagoj. La placebo-traktitaj kontroloj estis irigaciitaj per 500 ml da sterila distilita akvo. Ĉiuj traktadoj estis efektivigitaj sub forcejaj kondiĉoj (25 ± 2°C, 75 ± 1% relativa humideco, kaj fotoperiodo de 8 h da lumo/16 h da mallumo). Ĉiuj potoj estis akvumitaj ĉiun duan semajnon kaj traktitaj ĉiumonate per ekvilibra NPK-sterko (20-20-20, kun 3,6% da sulfuro kaj TE-mikroelementoj; Zain Seeds, Egiptujo) je koncentriĝo de 3–4 g/l per foliara ŝprucado laŭ la rekomendoj por la specifa vario kaj la instrukcioj de la fabrikanto. Krom se alie dirite, plene eksponitaj maturaj folioj (2a kaj 3a folioj de supre) estis kolektitaj de ĉiu biologia ripeto 72 horojn post la traktado, homogenigitaj, kunigitaj kaj konservitaj je -80 °C por pliaj analizoj inkluzive de, sed ne limigite al, surloka histokemia lokalizo de oksidativaj stresindikiloj, lipida peroksidado, enzimecaj kaj ne-enzimecaj antioksidantoj kaj genekspresio.
La intenseco de blanka ŝimo-infekto estis taksita ĉiusemajne 21 tagojn post inokulado (dpi) uzante skalon de 1-9 (Aldona Tabelo S2) bazitan sur la skalo de Petzoldt kaj Dickson (1996) modifita de Teran et al. (2006). Mallonge, la tigoj kaj branĉoj de fazeolo-plantoj estis ekzamenitaj komencante ĉe la punkto de inokulado por sekvi la progreson de lezoj laŭ internodoj kaj nodoj. La distanco de la lezo de la punkto de inokulado ĝis la plej fora punkto laŭ la tigo aŭ branĉo estis tiam mezurita kaj poentaro de 1-9 estis asignita surbaze de la loko de la lezo, kie (1) indikis neniun videblan infekton proksime al la punkto de inokulado kaj (2-9) indikis laŭpaŝan pliiĝon en la grandeco de lezo kaj progreso laŭ nodoj/internodoj (Aldona Tabelo S2). La intenseco de blanka ŝimo-infekto estis tiam konvertita al procento uzante formulon 2:
Krome, la areo sub la kurbo de malsanprogreso (AUDPC) estis kalkulita uzante la formulon (Shaner kaj Finney, 1977), kiu estis ĵus adaptita por blanka putro de ordinara fazeolo (Chauhan et al., 2020) uzante ekvacion 3:
Kie Yi = malsansevereco je tempo ti, Yi+1 = malsansevereco je la sekva tempo ti+1, ti = tempo de la unua mezurado (en tagoj), ti+1 = tempo de la sekva mezurado (en tagoj), n = tuta nombro de tempopunktoj aŭ observpunktoj. Kreskoparametroj de la fazeolo, inkluzive de plantalteco (cm), nombro da branĉoj po planto, kaj nombro da folioj po planto, estis registritaj ĉiusemajne dum 21 tagoj en ĉiuj biologiaj ripetoj.
En ĉiu biologia ripeto, foliaj specimenoj (dua kaj tria plene evoluintaj folioj de supre) estis kolektitaj je la 45-a tago post la traktado (15 tagojn post la lasta traktado). Ĉiu biologia ripeto konsistis el kvin potoj (du plantoj po poto). Ĉirkaŭ 500 mg da la dispremita histo estis uzitaj por la ekstraktado de fotosintezaj pigmentoj (klorofilo a, klorofilo b kaj karotenoidoj) uzante 80% acetonon je 4 °C en mallumo. Post 24 horoj, la specimenoj estis centrifugitaj kaj la supernatant estis kolektita por la determinado de la enhavo de klorofilo a, klorofilo b kaj karotenoidoj kolorimetrie uzante UV-160A spektrofotometron (Shimadzu Corporation, Japanio) laŭ la metodo de (Lichtenthaler, 1987) mezurante la absorbadon je tri malsamaj ondolongoj (A470, A646 kaj A663 nm). Fine, la enhavo de fotosintezaj pigmentoj estis kalkulita uzante la jenajn formulojn 4-6 priskribitajn de Lichtenthaler (1987).
Je 72 horoj post la traktado (hpt), folioj (dua kaj tria plene evoluintaj folioj de supre) estis kolektitaj de ĉiu biologia reproduktaĵo por surloka histokemia lokalizo de hidrogena peroksido (H2O2) kaj superoksida anjono (O2•−). Ĉiu biologia reproduktaĵo konsistis el kvin potoj (du plantoj po poto). Ĉiu biologia reproduktaĵo estis analizita duoble (du teknikaj reproduktaĵoj) por certigi la precizecon, fidindecon kaj reprodukteblecon de la metodo. H2O2 kaj O2•− estis determinitaj uzante 0.1% 3,3′-diaminobenzidinon (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germanio) aŭ nitrobluan tetrazolion (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germanio), respektive, sekvante la metodojn priskribitajn de Romero-Puertas et al. (2004) kaj Adam et al. (1989) kun malgrandaj modifoj. Por histokemia lokalizo de H2O2 surloke, la folietoj estis vakue infiltritaj per 0.1% DAB en 10 mM Tris-bufro (pH 7.8) kaj poste kovitaj je ĉambra temperaturo en lumo dum 60 minutoj. La folietoj estis blankigitaj en 0.15% (v/v) TCA en 4:1 (v/v) etanolo:kloroformo (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egiptujo) kaj poste eksponitaj al lumo ĝis ili malheliĝis. Simile, la valvoj estis vakue infiltritaj per 10 mM kalia fosfata bufro (pH 7.8) enhavanta 0.1 p/v % HBT por histokemia lokalizo de O2•− surloke. La folietoj estis inkubitaj en lumo je ĉambra temperaturo dum 20 minutoj, poste blankigitaj kiel supre, kaj poste lumigitaj ĝis aperis malhelbluaj/violaĵaj makuloj. La intenseco de la rezulta bruna (kiel H2O2 indikilo) aŭ bluviola (kiel O2•− indikilo) koloro estis taksita uzante la fiĝian version de la bildprilabora programaro ImageJ (http://fiji.sc; alirita la 7an de marto 2024).
Malondialdehido (MDA; kiel indikilo de lipida peroksidado) estis determinita laŭ la metodo de Du kaj Bramlage (1992) kun iometaj modifoj. Folioj de ĉiu biologia ripeto (dua kaj tria plene evoluintaj folioj de supre) estis kolektitaj 72 horojn post la traktado (hpt). Ĉiu biologia ripeto inkluzivis kvin potojn (du plantoj po poto). Ĉiu biologia ripeto estis analizita duoble (du teknikaj ripetoj) por certigi la precizecon, fidindecon kaj reprodukteblecon de la metodo. Mallonge, 0.5 g da muelita folia histo estis uzitaj por MDA-ekstraktado kun 20% trikloroacetata acido (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, Usono) enhavanta 0.01% butilitan hidroksitoluenon (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Usono). La MDA-enhavo en la supernatanto estis poste determinita kolorimetrie per mezurado de la absorbado je 532 kaj 600 nm uzante UV-160A-spektrofotometron (Shimadzu Corporation, Japanio) kaj poste esprimita kiel nmol g−1 FW.
Por taksado de ne-enzimaj kaj enzimaj antioksidantoj, folioj (dua kaj tria plene evoluintaj folioj de supre) estis kolektitaj de ĉiu biologia ripeto 72 horojn post la traktado (hpt). Ĉiu biologia ripeto konsistis el kvin potoj (du plantoj po poto). Ĉiu biologia specimeno estis analizita duoble (du teknikaj specimenoj). Du folioj estis muelitaj per likva nitrogeno kaj uzitaj rekte por determinado de enzimaj kaj ne-enzimaj antioksidantoj, totalaj aminoacidoj, prolina enhavo, gena esprimo kaj oksalata kvantigo.
Totalaj solveblaj fenoloj estis determinitaj uzante la reakciaĵon Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Usono) kun iometaj modifoj de la metodo priskribita de Kahkonen et al. (1999). Mallonge, ĉirkaŭ 0.1 g da homogenigita folihisto estis ekstraktita per 20 ml da 80% metanolo en mallumo dum 24 horoj kaj la supernatanto estis kolektita post centrifugado. 0.1 ml da la prova ekstrakto estis miksita kun 0.5 ml da reakciaĵo Folin-Ciocalteu (10%), skuita dum 30 sekundoj kaj lasita en mallumo dum 5 minutoj. Poste 0.5 ml da 20%-a natria karbonata solvaĵo (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kairo, Egiptujo) estis aldonita al ĉiu tubo, bone miksita kaj inkubita je ĉambra temperaturo en mallumo dum 1 horo. Post inkubacio, la absorbado de la reakcia miksaĵo estis mezurita je 765 nm uzante UV-160A spektrofotometron (Shimadzu Corporation, Japanio). La koncentriĝo de totalaj solveblaj fenoloj en la provaĵaj ekstraktoj estis determinita uzante galacidan kalibran kurbon (Fisher Scientific, Hampton, NH, Usono) kaj esprimita kiel miligramoj da galacida ekvivalento por gramo da freŝa pezo (mg GAE g-1 freŝa pezo).
La totala solvebla flavonoida enhavo estis determinita laŭ la metodo de Djeridane et al. (2006) kun iometaj modifoj. Mallonge, 0.3 ml de la supre menciita metanola ekstrakto estis miksita kun 0.3 ml de 5%-a aluminioklorida solvaĵo (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, Usono), forte kirlita kaj poste inkubita je ĉambra temperaturo dum 5 minutoj, sekvata de aldono de 0.3 ml de 10%-a kalia acetata solvaĵo (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egiptujo), plene miksita kaj inkubita je ĉambra temperaturo dum 30 minutoj en mallumo. Post inkubacio, la absorbado de la reakcia miksaĵo estis mezurita je 430 nm uzante UV-160A spektrofotometron (Shimadzu Corporation, Japanio). La koncentriĝo de totalaj solveblaj flavonoidoj en provaĵaj ekstraktoj estis determinita uzante rutinan kalibran kurbon (TCI America, Portlando, Oregono, Usono) kaj poste esprimita kiel miligramoj da rutina ekvivalento por gramo da freŝa pezo (mg RE g-1 freŝa pezo).
La totala enhavo de liberaj aminoacidoj en fazeolaj folioj estis determinita per modifita ninhidrina reakciaĵo (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, Usono) bazita sur la metodo proponita de Yokoyama kaj Hiramatsu (2003) kaj modifita de Sun et al. (2006). Mallonge, 0.1 g da muelita histo estis ekstraktita per pH 5.4 bufrosolvaĵo, kaj 200 μL da supernatant estis reagita kun 200 μL da ninhidrino (2%) kaj 200 μL da piridino (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, Usono), kovita en bolanta akvobano dum 30 minutoj, poste malvarmigita kaj mezurita je 580 nm uzante UV-160A spektrofotometron (Shimadzu Corporation, Japanio). Aliflanke, prolino estis determinita per la Bates-metodo (Bates et al., 1973). Prolino estis ekstraktita per 3% sulfosalicila acido (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, Usono) kaj post centrifugado, 0.5 ml da la supernatanto estis miksita kun 1 ml da glacia acetata acido (Fisher Scientific, Hampton, NH, Usono) kaj ninhidrina reakciilo, inkubita je 90°C dum 45 minutoj, malvarmigita kaj mezurita je 520 nm uzante la saman spektrofotometron kiel supre. Totalaj liberaj aminoacidoj kaj prolino en la foliekstraktoj estis determinitaj uzante glicinajn kaj prolinajn kalibradajn kurbojn (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Usono), respektive, kaj esprimitaj kiel mg/g da freŝa pezo.
Por determini la enziman aktivecon de antioksidaj enzimoj, ĉirkaŭ 500 mg da homogenigita histo estis ekstraktitaj per 3 ml da 50 mM Tris-bufro (pH 7.8) enhavanta 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Usono) kaj 7.5% polivinilpirolidonon (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Usono), centrifugitaj je 10,000 × g dum 20 minutoj sub fridigo (4 °C), kaj la supernatanto (kruda enzima ekstrakto) estis kolektita (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Katalazo (CAT) estis poste reagita kun 2 ml da 0.1 M natria fosfata bufro (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Usono) kaj 100 μl da 269 mM H2O2-solvaĵo por determini ĝian enziman aktivecon laŭ la metodo de Aebi (1984) kun iometaj modifoj (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). La enzima aktiveco de guajacol-dependa peroksidazo (POX) estis determinita uzante la metodon de Harrach et al. (2009). (2008) kun malgrandaj modifoj (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) kaj la enzima aktiveco de polifenola oksidazo (PPO) estis determinita post reakcio kun 2,2 ml da 100 mM natria fosfata bufro (pH 6,0), 100 μl da gvajakolo (TCI chemicals, Portland, OR, Usono) kaj 100 μl da 12 mM H2O2. La metodo estis iomete modifita de (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). La analizo estis farita post reakcio kun 3 ml da katekola solvaĵo (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, Usono) (0,01 M) freŝe preparita en 0,1 M fosfata bufro (pH 6,0). CAT-aktiveco estis mezurita per monitorado de la malkomponiĝo de H2O2 je 240 nm (A240), POX-aktiveco estis mezurita per monitorado de la pliiĝo de absorbado je 436 nm (A436), kaj PPO-aktiveco estis mezurita per registrado de absorbadaj fluktuoj je 495 nm (A495) ĉiujn 30 sekundojn dum 3 minutoj uzante UV-160A-spektrofotometron (Shimadzu, Japanio).
Realtempa RT-PCR estis uzata por detekti la transskribaĵnivelojn de tri antioksidant-rilataj genoj, inkluzive de peroksisoma katalazo (PvCAT1; GenBank Alirnumero KF033307.1), superoksida dismutazo (PvSOD; GenBank Alirnumero XM_068639556.1), kaj glutationa reduktazo (PvGR; GenBank Alirnumero KY195009.1), en fazeolaj folioj (la dua kaj tria plene evoluintaj folioj de supre) 72 horojn post la lasta traktado. Mallonge, RNA estis izolita uzante Simply P Total RNA Extraction Kit (Katalognumero BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Ĉinio) laŭ la protokolo de la fabrikanto. Poste, cDNA estis sintezita uzante TOP script™ cDNA Synthesis Kit laŭ la instrukcioj de la fabrikanto. La prajmersekvencoj de la supre menciitaj tri genoj estas listigitaj en Aldona Tabelo S3. PvActin-3 (GenBank-surskribo-numero: XM_068616709.1) estis uzata kiel la ĉefa geno kaj la relativa gena esprimo estis kalkulita per la 2-ΔΔCT-metodo (Livak kaj Schmittgen, 2001). Aktina stabileco sub biota streso (nekongrua interagado inter ordinaraj guŝoj kaj la antraknoza fungo Colletotrichum lindemuthianum) kaj abiota streso (sekeco, saleco, malalta temperaturo) estis montrita (Borges et al., 2012).
Ni komence plenumis tutgenoman in silico analizon de oksaloacetata acetilhidrolazaj (OAH) proteinoj en S. sclerotiorum uzante la protein-proteinan BLAST-ilon (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Mallonge, ni uzis OAH de Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taksido: 1191702; GenBank-alirnumero XP_040799428.1; 342 aminoacidoj) kaj Penicillium lagena (PlOAH; taksido: 94218; GenBank-alirnumero XP_056833920.1; 316 aminoacidoj) kiel serĉsekvencojn por mapi la homologan proteinon en S. sclerotiorum (taksido: 5180). BLASTp estis efektivigita kontraŭ la plej lastatempe haveblaj genomaj datumoj de S. sclerotiorum en GenBank en la retejo de la Nacia Centro por Bioteknologia Informo (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Krome, la antaŭdirita OAH-geno el S. sclerotiorum (SsOAH) kaj la evolua analizo kaj filogenetika arbo de AfOAH el A. fijiensis CBS 313.89 kaj PlOAH el P. lagena estis deduktitaj uzante la maksimuman verŝajnecan metodon en MEGA11 (Tamura et al., 2021) kaj la JTT-matrico-bazitan modelon (Jones et al., 1992). La filogenetika arbo estis kombinita kun la plurliniiga analizo de proteinaj sekvencoj de ĉiuj antaŭdiritaj OAH-genoj (SsOAH) el S. sclerotiorum kaj la serĉsekvenco uzante la Limo-Bazitan Alignigan Ilon (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos kaj Agarwala, 2007). Krome, la plej bone kongruaj aminoacidaj sekvencoj de SsOAH el S. sclerotiorum estis vicigitaj kun la serĉsekvencoj (AfOAH kaj PlOAH) (Larkin et al., 2007) uzante ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), kaj konservitaj regionoj en la vicigo estis bildigitaj uzante la ilon ESPript (versio 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Plue, la antaŭdiritaj funkciaj reprezentaj domajnoj kaj konservitaj lokoj de S. sclerotiorum SsOAH estis interage klasifikitaj en malsamajn familiojn uzante la ilon InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Fine, tridimensia (3D) strukturmodelado de la antaŭdirita S. sclerotiorum SsOAH estis farita uzante la Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 servilo versio 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) kaj validigita uzante la SWISS-MODEL servilon (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). La antaŭdiritaj tridimensiaj strukturoj (PDB-formato) estis interage bildigitaj uzante la pakaĵon UCSF-Chimera (versio 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Kvanta realtempa fluoreska PCR estis uzata por determini la transkripcian nivelon de oksaloacetata acetilhidrolazo (SsOAH; GenBank-surskriba numero: XM_001590428.1) en la micelioj de Sclerotinia sclerotiorum. Mallonge, S. sclerotiorum estis inokulita en flakonon enhavantan PDB kaj metita en skuantan inkubatoron (modelo: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, Usono) je 25 ± 2 °C dum 24 horoj je 150 rpm kaj en konstanta mallumo (24 horoj) por stimuli micelan kreskon. Poste, la ĉeloj estis traktitaj per L-ornitino kaj la fungicido Rizolex-T je finaj IC50-koncentriĝoj (proksimume 40 kaj 3.2 mg/L, respektive) kaj poste kultivitaj dum pliaj 24 horoj sub la samaj kondiĉoj. Post inkubacio, la kulturoj estis centrifugitaj je 2500 rpm dum 5 minutoj kaj la supernatanto (funga micelio) estis kolektita por analizo de gena esprimo. Simile, funga micelio estis kolektita je 0, 24, 48, 72, 96 kaj 120 horoj post infekto de infektitaj plantoj, kiuj formis blankan ŝimon kaj kotonecan micelion sur la surfaco de infektitaj histoj. RNA estis ekstraktita el la funga micelio kaj poste cDNA estis sintezita kiel priskribite supre. La enkondukaj sekvencoj por SsOAH estas listigitaj en Aldona Tabelo S3. SsActin (GenBank-surskriba numero: XM_001589919.1) estis uzata kiel la ĉefa geno, kaj relativa gena esprimo estis kalkulita uzante la 2-ΔΔCT-metodon (Livak kaj Schmittgen, 2001).
Oksala acido estis determinita en terpoma dekstroza buljono (PDB) kaj plantospecimenoj enhavantaj la fungan patogenon Sclerotinia sclerotiorum laŭ la metodo de Xu kaj Zhang (2000) kun iometaj modifoj. Mallonge, S. sclerotiorum-izolataĵoj estis inokulitaj en flakonoj enhavantaj PDB kaj poste kultivitaj en skuanta inkubatoro (modelo I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, Usono) je 150 rpm je 25 ± 2 °C dum 3-5 tagoj en konstanta mallumo (24 h) por stimuli micelian kreskon. Post inkubacio, la funga kulturo unue estis filtrita tra Whatman #1 filtrilpapero kaj poste centrifugita je 2500 rpm dum 5 minutoj por forigi restan micelion. La supernatant estis kolektita kaj konservita je 4 °C por plia kvanta determinado de oksalato. Por la preparado de plantospecimenoj, ĉirkaŭ 0.1 g da plantohistaj fragmentoj estis ekstraktitaj tri fojojn per distilita akvo (2 ml ĉiufoje). La specimenoj estis poste centrifugitaj je 2500 rpm dum 5 minutoj, la supernatanto estis seke filtrita tra Whatman-numero 1 filtropapero kaj kolektita por plia analizo.
Por kvanta analizo de oksala acido, la reakcia miksaĵo estis preparita en vitra ŝtopilo en la jena ordo: 0,2 ml da specimeno (aŭ PDB-kulturfiltraĵo aŭ oksalacida norma solvaĵo), 0,11 ml da bromofenola bluo (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, Usono), 0,198 ml da 1 M sulfata acido (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egiptujo) kaj 0,176 ml da 100 mM kalia dikromato (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, Usono), kaj poste la solvaĵo estis diluita ĝis 4,8 ml per distilita akvo, forte miksita kaj tuj metita en 60 °C akvobanon. Post 10 minutoj, la reakcio estis haltigita per aldono de 0,5 ml da natria hidroksida solvaĵo (NaOH; 0,75 M). La absorbado (A600) de la reakcia miksaĵo estis mezurita je 600 nm uzante UV-160-spektrofotometron (Shimadzu Corporation, Japanio). PDB kaj distilita akvo estis uzitaj kiel kontroloj por la kvantigo de kulturfiltraĵoj kaj plantspecimenoj, respektive. La oksalacidaj koncentriĝoj en la kulturfiltraĵoj, esprimitaj kiel mikrogramoj da oksala acido por mililitro da PDB-medio (μg.mL−1), kaj en la foliekstraktoj, esprimitaj kiel mikrogramoj da oksala acido por gramo da freŝa pezo (μg.g−1 FW), estis determinitaj uzante oksalacidan kalibran kurbon (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, Usono).
Dum la tuta studo, ĉiuj eksperimentoj estis dizajnitaj laŭ tute hazarda dezajno (CRD) kun ses biologiaj ripetoj por traktado kaj kvin potoj por biologia ripeto (du plantoj por poto) krom se alie indikite. Biologiaj ripetoj estis analizitaj duoble (du teknikaj ripetoj). Teknikaj ripetoj estis uzitaj por kontroli la reprodukteblecon de la sama eksperimento, sed ne estis uzitaj en la statistika analizo por eviti falsajn ripetojn. Datumoj estis statistike analizitaj uzante variancan analizon (ANOVA) sekvitan de la Tukey-Kramer honeste signifa diferenco (HSD) testo (p ≤ 0.05). Por in vitro eksperimentoj, IC50 kaj IC99 valoroj estis kalkulitaj uzante la probit modelon kaj 95% konfidintervaloj estis kalkulitaj.
Entute kvar izolitaĵoj estis kolektitaj el malsamaj sojfabaj kampoj en la gubernio El Ghabiya, Egiptujo. Sur PDA-medio, ĉiuj izolitaĵoj produktis kremblankan micelion, kiu rapide fariĝis kotoneca blanka (Figuro 1A) kaj poste flavgriza aŭ bruna en la sklerocia stadio. Sklerotoj estas kutime densaj, nigraj, sferaj aŭ neregulaj laŭ formo, 5,2 ĝis 7,7 mm longaj kaj 3,4 ĝis 5,3 mm en diametro (Figuro 1B). Kvankam kvar izolitaĵoj evoluigis marĝenan padronon de sklerotoj ĉe la rando de la kulturmedio post 10-12 tagoj da inkubacio je 25 ± 2 °C (Figuro 1A), la nombro de sklerotoj por plato estis signife malsama inter ili (P < 0,001), kun izolitaĵo 3 havanta la plej altan nombron de sklerotoj (32,33 ± 1,53 sklerotoj por plato; Figuro 1C). Simile, izolitaĵo n-ro 3 produktis pli da oksala acido en PDB ol aliaj izolitaĵoj (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Fig. 1D). Izolitaĵo n-ro 3 montris tipajn morfologiajn kaj mikroskopajn karakterizaĵojn de la fitopatogena fungo Sclerotinia sclerotiorum. Ekzemple, sur PDA, kolonioj de izolitaĵo n-ro 3 kreskis rapide, estis kremblankaj (Figuro 1A), inverse flavgrizaj aŭ helsalmflavbrunaj, kaj bezonis 6-7 tagojn je 25 ± 2°C por tute kovri la surfacon de 9 cm diametra plato. Surbaze de la supre menciitaj morfologiaj kaj mikroskopaj karakterizaĵoj, izolitaĵo n-ro 3 estis identigita kiel Sclerotinia sclerotiorum.
Figuro 1. Karakterizaĵoj kaj patogeneco de S. sclerotiorum-izolataĵoj el komunaj guŝaj kultivaĵoj. (A) Micela kresko de kvar S. sclerotiorum-izolataĵoj sur PDA-medio, (B) sklerotoj de kvar S. sclerotiorum-izolataĵoj, (C) nombro da sklerotoj (po plato), (D) oksalacida sekrecio sur PDB-medio (μg.mL−1), kaj (E) malsansevereco (%) de kvar S. sclerotiorum-izolataĵoj sur sentema komerca guŝa kulturvario Giza 3 sub forcejaj kondiĉoj. Valoroj reprezentas la meznombron ± norma devio de kvin biologiaj ripetoj (n = 5). Malsamaj literoj indikas statistike signifajn diferencojn inter traktadoj (p < 0,05). (F–H) Tipaj simptomoj de blanka ŝimo aperis sur superteraj tigoj kaj silikvoj, respektive, 10 tagojn post inokulado kun izolitaĵo n-ro 3 (dpi). (I) Evolua analizo de la interna transskribita interaĵo (ITS) de S. sclerotiorum izolitaĵo n-ro 3 estis farita uzante la maksimuman verŝajnecan metodon kaj komparita kun 20 referencaj izolitaĵoj/trostreĉoj akiritaj de la datumbazo de la Nacia Centro por Bioteknologia Informo (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). La nombroj super la grupiĝaj linioj indikas la regionan kovron (%), kaj la nombroj sub la grupiĝaj linioj indikas la branĉlongon.
Plue, por konfirmi la patogenecon, kvar akiritaj S. sclerotiorum-izolataĵoj estis uzitaj por inokuli la senteman komercan fabkulturvarion Giza 3 sub forcejaj kondiĉoj, kio kongruas kun la postulatoj de Koch (Fig. 1E). Kvankam ĉiuj akiritaj fungaj izolataĵoj estis patogenaj kaj povis infekti la verdan fabon (cv. Giza 3), kaŭzante tipajn simptomojn de blanka ŝimo sur ĉiuj superteraj partoj (Fig. 1F), precipe sur la tigoj (Fig. 1G) kaj guŝoj (Fig. 1H) 10 tagojn post inokulado (dpi), izolataĵo 3 estis la plej agresema izolataĵo en du sendependaj eksperimentoj. Izolataĵo 3 havis la plej altan malsanseverecon (%) sur fabplantoj (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, kaj 76.7 ± 3.1 je 7, 14, kaj 21 tagoj post infekto, respektive; Figuro 1F).
La identigo de la plej enpenetra S. sclerotiorum izolitaĵo n-ro 3 estis plue konfirmita surbaze de interna transskribita interaĵo (ITS) sekvencado (Fig. 1I). Filogenetika analizo inter izolitaĵo n-ro 3 kaj 20 referencaj izolitaĵoj/trostreĉoj montris altan similecon (>99%) inter ili. Indas rimarki, ke la S. sclerotiorum izolitaĵo n-ro 3 (533 bp) havas altan similecon al la usona S. sclerotiorum izolitaĵo LPM36 izolita el sekaj pizosemoj (GenBank-surskriba numero MK896659.1; 540 bp) kaj la ĉina S. sclerotiorum izolitaĵo YKY211 (GenBank-surskriba numero OR206374.1; 548 bp), kiu kaŭzas violan (Matthiola incana) tigputron, kiuj ĉiuj estas grupigitaj aparte ĉe la pinto de la dendrogramo (Figuro 1I). La nova sekvenco estis deponita en la NCBI-datumbazo kaj nomita "Sclerotinia sclerotiorum - izolitaĵo YN-25" (GenBank-surskriba numero PV202792). Videblas, ke izolitaĵo 3 estas la plej invada izolitaĵo; tial, ĉi tiu izolitaĵo estis elektita por studo en ĉiuj postaj eksperimentoj.
La kontraŭbakteria aktiveco de la diamino L-ornitino (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germanio) ĉe malsamaj koncentriĝoj (12,5, 25, 50, 75, 100 kaj 125 mg/L) kontraŭ S. sclerotiorum izolitaĵo 3 estis esplorita in vitro. Rimarkinde, L-ornitino penis kontraŭbakterian efikon kaj iom post iom inhibis la radian kreskon de S. sclerotiorum hifoj laŭ doz-dependa maniero (Figuro 2A, B). Ĉe la plej alta testita koncentriĝo (125 mg/L), L-ornitino montris la plej altan inhibician indicon de micela kresko (99,62 ± 0,27%; Figuro 2B), kiu estis ekvivalenta al la komerca fungicido Rizolex-T (inhibiciiga indico 99,45 ± 0,39%; Figuro 2C) ĉe la plej alta testita koncentriĝo (10 mg/L), indikante similan efikecon.
Figuro 2. En vitro kontraŭbakteria aktiveco de L-ornitino kontraŭ Sclerotinia sclerotiorum. (A) Komparo de la kontraŭbakteria aktiveco de malsamaj koncentriĝoj de L-ornitino kontraŭ S. sclerotiorum kun la komerca fungicido Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Inhibicia indico (%) de micela kresko de S. sclerotiorum post traktado kun malsamaj koncentriĝoj de L-ornitino (12,5, 25, 50, 75, 100 kaj 125 mg/L) aŭ Rizolex-T (2, 4, 6, 8 kaj 10 mg/L), respektive. La valoroj reprezentas la meznombron ± norma devio de kvin biologiaj ripetoj (n = 5). Malsamaj literoj indikas statistikajn diferencojn inter traktadoj (p < 0,05). (D, E) Probit-modela regresanalizo de L-ornitino kaj komerca fungicido Rizolex-T, respektive. La regreslinio de la probit-modelo estas montrita kiel solida blua linio, kaj la konfidencintervalo (95%) estas montrita kiel streketota ruĝa linio.
Krome, probita regresa analizo estis farita kaj la respondaj grafikaĵoj estas montritaj en Tabelo 1 kaj Figuroj 2D,E. Mallonge, la akceptebla dekliva valoro (y = 2.92x − 4.67) kaj asociitaj signifaj statistikoj (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 kaj p < 0.0001; Figuro 2D) de L-ornitino indikis plibonigitan kontraŭfungan agadon kontraŭ S. sclerotiorum kompare kun la komerca fungicido Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 kaj p < 0.0001) (Tabelo 1).
Tabelo 1. Valoroj de duonmaksimuma inhibicia koncentriĝo (IC50) kaj IC99 (mg/l) de L-ornitino kaj komerca fungicido "Rizolex-T" kontraŭ S. sclerotiorum.
Ĝenerale, L-ornitino (250 mg/L) signife reduktis la disvolviĝon kaj severecon de blanka ŝimo sur traktitaj ordinaraj fazeolaj plantoj kompare kun netraktitaj S. sclerotiorum-infektitaj plantoj (kontrolo; Figuro 3A). Mallonge, kvankam la malsansevereco de netraktitaj infektitaj kontrolplantoj iom post iom pliiĝis (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61, kaj 92,33 ± 3,06%), L-ornitino signife reduktis la malsanseverecon (%) dum la tuta eksperimento (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00, kaj 26,36 ± 3,07) je 7, 14, kaj 21 tagoj post la traktado (dpt), respektive (Figuro 3A). Simile, kiam fazeolo-plantoj infektitaj de S. sclerotiorum estis traktitaj per 250 mg/L L-ornitino, la areo sub la malsanprogreskurbo (AUDPC) malpliiĝis de 1274,33 ± 33,13 en la netraktita kontrolo al 281,03 ± 7,95, kio estis iomete pli malalta ol tiu de la pozitiva kontrolo 50 mg/L Rizolex-T fungicido (183,61 ± 7,71; Fig. 3B). La sama tendenco estis observita en la dua eksperimento.
Fig. 3. Efiko de ekstera apliko de L-ornitino sur la disvolviĝo de blanka putro de ordinara fazeolo kaŭzita de Sclerotinia sclerotiorum sub forcejaj kondiĉoj. (A) Kurbo de malsanprogreso de blanka ŝimo de ordinara fazeolo post traktado kun 250 mg/L L-ornitino. (B) Areo sub la kurbo de malsanprogreso (AUDPC) de blanka ŝimo de ordinara fazeolo post traktado kun L-ornitino. Valoroj reprezentas la meznombron ± norma devio de kvin biologiaj ripetoj (n = 5). Malsamaj literoj indikas statistike signifajn diferencojn inter traktadoj (p < 0,05).
Ekstera apliko de 250 mg/L L-ornitino iom post iom pliigis la plantaltecon (Fig. 4A), la nombron de branĉoj po planto (Fig. 4B), kaj la nombron de folioj po planto (Fig. 4C) post 42 tagoj. Dum la komerca fungicido Rizolex-T (50 mg/L) havis la plej grandan efikon sur ĉiuj studitaj nutraj parametroj, ekstera apliko de 250 mg/L L-ornitino havis la duan plej grandan efikon kompare kun netraktitaj kontroloj (Fig. 4A–C). Aliflanke, L-ornitina traktado ne havis signifan efikon sur la enhavo de fotosintezaj pigmentoj klorofilo a (Fig. 4D) kaj klorofilo b (Fig. 4E), sed iomete pliigis la totalan karotenoidan enhavon (0,56 ± 0,03 mg/g pez-bazita) kompare kun la negativa kontrolo (0,44 ± 0,02 mg/g pez-bazita) kaj pozitiva kontrolo (0,46 ± 0,02 mg/g pez-bazita; Fig. 4F). Ĝenerale, ĉi tiuj rezultoj indikas, ke L-ornitino ne estas fitotoksa por traktitaj guŝoj kaj eĉ povas stimuli ilian kreskon.
Fig. 4. Efiko de apliko de eksogena L-ornitino sur kreskokarakterizaĵoj kaj fotosintezaj pigmentoj de fazeolaj folioj infektitaj per Sclerotinia sclerotiorum sub forcejaj kondiĉoj. (A) Plantalteco (cm), (B) Nombro da branĉoj po planto, (C) Nombro da folioj po planto, (D) Enhavo de klorofilo a (mg g⁻¹ pez.), (E) Enhavo de klorofilo b (mg g⁻¹ pez.), (F) Totala enhavo de karotenoidoj (mg g⁻¹ pez.). La valoroj estas la meznombro ± norma devio de kvin biologiaj ripetoj (n = 5). Malsamaj literoj indikas statistike signifajn diferencojn inter traktadoj (p < 0,05).
En situ histokemia lokigo de reaktivaj oksigenaj specioj (ROS; esprimitaj kiel hidrogena peroksido [H2O2]) kaj liberaj radikaluloj (esprimitaj kiel superoksidaj anjonoj [O2•−]) rivelis, ke eksogena apliko de L-ornitino (250 mg/L) signife reduktis la amasiĝon de H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) kaj O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) kompare kun la amasiĝo de ambaŭ netraktitaj infektitaj plantoj (173,31 ± 12,06 kaj 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, respektive) kaj plantoj traktitaj per 50 mg/L de la komerca fungicido Rizolex-T (170,12 ± 9,50 kaj 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, respektive) je 72 horoj. Altaj niveloj de H2O2 kaj O2•− akumuliĝis sub alta temperaturo (Fig. 5A, B). Simile, TCA-bazita malondialdehida (MDA) analizo montris, ke S. sclerotiorum-infektitaj fazeolplantoj akumulis pli altajn nivelojn de MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) en siaj folioj (Fig. 5C). Tamen, eksogena apliko de L-ornitino signife reduktis lipidan peroksidadon, kiel montras la malpliiĝo de MDA-enhavo en traktitaj plantoj (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Efiko de apliko de eksogena L-ornitino sur ĉefajn indikilojn de oksidativa streso kaj ne-enzimajn antioksidajn defendmekanismojn en fazeolaj folioj infektitaj per S. sclerotiorum 72 horojn post infekto sub forcejaj kondiĉoj. (A) Hidrogena peroksido (H2O2; nmol g−1 FW) je 72 hpt, (B) superoksida anjono (O2•−; nmol g−1 FW) je 72 hpt, (C) malondialdehido (MDA; nmol g−1 FW) je 72 hpt, (D) totalaj solveblaj fenoloj (mg GAE g−1 FW) je 72 hpt, (E) totalaj solveblaj flavonoidoj (mg RE g−1 FW) je 72 hpt, (F) totalaj liberaj aminoacidoj (mg g−1 FW) je 72 hpt, kaj (G) prolina enhavo (mg g−1 FW) je 72 hpt. La valoroj reprezentas la meznombron ± norman devion (meznombro ± norma devio) de 5 biologiaj ripetoj (n = 5). Malsamaj literoj indikas statistike signifajn diferencojn inter traktadoj (p < 0,05).