Ni antaŭe raportis, ke serumaj niveloj de la intest-derivita triptofana metabolito indole-3-propiona acido (IPA) estas pli malaltaj ĉe pacientoj kun hepata fibrozo. En ĉi tiu studo, ni esploris la transkriptomon kaj DNA-metilomon en obezaj hepatoj rilate al serumaj IPA-niveloj, same kiel la rolon de IPA en indukto de fenotipa malaktivigo de hepataj stelĉeloj (HSC-oj) in vitro.
La studo inkluzivis 116 obezajn pacientojn sen tipo 2 diabeto (T2DM) (aĝo 46.8 ± 9.3 jaroj; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²), kiuj spertis bariatrian kirurgion ĉe la Kuopio Bariatric Surgery Center (KOBS). Cirkulantaj IPA-niveloj estis mezuritaj per likva kromatografio-masa spektrometrio (LC-MS), analizo de hepata transkriptomo estis farita per totala RNA-sekvencado, kaj analizo de DNA-metiligo estis farita uzante la Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Homaj hepataj stelformaj ĉeloj (LX-2) estis uzitaj por en vitraj eksperimentoj.
Serumaj IPA-niveloj korelaciis kun la esprimo de genoj implikitaj en apoptozaj, mitofagaj kaj longvivecaj vojoj en la hepato. La AKT-serino/treonina kinazo 1 (AKT1) geno estis la plej abunda kaj domina interaganta geno en la hepataj transskribaĵoj kaj DNA-metiligaj profiloj. IPA-traktado induktis apoptozon, malpliigis mitokondrian spiradon, kaj ŝanĝis ĉelmorfologion kaj mitokondrian dinamikon per modulado de la esprimo de genoj konataj pro reguligado de fibrozo, apoptozo kaj supervivo de LX-2-ĉeloj.
Kune, ĉi tiuj datumoj subtenas, ke IPA havas eblajn terapiajn efikojn kaj povas indukti apoptozon kaj ŝanĝi la HSC-fenotipon al neaktiva stato, tiel vastigante la eblecon inhibicii hepatfibrozon per interrompado de HSC-aktivigo kaj mitokondria metabolo.
La tropezo de obezeco kaj metabola sindromo estis asociita kun kreskanta incidenco de metabole asociita grasa hepatmalsano (MASLD); la malsano tuŝas 25% ĝis 30% de la ĝenerala loĝantaro [1]. La ĉefa konsekvenco de MASLD-etiologio estas hepata fibrozo, dinamika procezo karakterizita per kontinua amasiĝo de fibreca eksterĉela matrico (ECM) [2]. La ĉefaj ĉeloj implikitaj en hepata fibrozo estas hepataj stelformaj ĉeloj (HSC-oj), kiuj montras kvar konatajn fenotipojn: kvietaj, aktivigitaj, malaktivigitaj kaj seneskaj [3, 4]. HSC-oj povas esti aktivigitaj kaj transdiferenciĝi de kvieta formo en proliferajn fibroblast-similajn ĉelojn kun altaj energiaj bezonoj, kun pliigita esprimo de α-glata muskola aktino (α-SMA) kaj tipo I kolageno (Col-I) [5, 6]. Dum hepata fibrozo-inversigo, aktivigitaj HSC-oj estas eliminitaj per apoptozo aŭ malaktivigo. Ĉi tiuj procezoj inkluzivas malsuprenreguligon de fibrogenaj genoj kaj moduladon de prosupervivaj genoj (kiel ekzemple NF-κB kaj PI3K/Akt signalaj vojoj) [7, 8], same kiel ŝanĝojn en mitokondria dinamiko kaj funkcio [9].
Serumaj niveloj de la triptofana metabolito indole-3-propiona acido (IPA), produktita en la intesto, estis trovitaj malpliigitaj en homaj metabolaj malsanoj inkluzive de MASLD [10–13]. IPA estas asociita kun konsumado de manĝfibroj, estas konata pro siaj antioksidaj kaj kontraŭinflamaj efikoj, kaj malpliigas la diet-induktitan ne-alkoholan steatohepatitan (NASH) fenotipon in vivo kaj in vitro [11–14]. Iuj pruvoj venas de nia antaŭa studo, kiu montris, ke serumaj IPA-niveloj estis pli malaltaj en pacientoj kun hepata fibrozo ol en obesaj pacientoj sen hepata fibrozo en la Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS). Krome, ni montris, ke IPA-traktado povus redukti la esprimon de genoj, kiuj estas klasikaj markiloj de ĉela adhero, ĉela migrado kaj hematopoeza stamĉela aktivigo en homa hepata stelĉela (LX-2) modelo kaj estas ebla hepatoprotekta metabolito [15]. Tamen, restas neklare kiel IPA induktas hepatfibrozan regreson per aktivigo de HSC-apoptozo kaj mitokondria bioenergetiko.
Ĉi tie, ni montras, ke seruma IPA estas asociita kun la esprimo de genoj riĉigitaj per apoptozo, mitofagio, kaj longvivecaj vojoj en la hepato de obesaj sed ne-tipo 2 diabeto (KOBS) individuoj. Krome, ni trovis, ke IPA povas indukti la forigon kaj degeneron de aktivigitaj hematopoezaj stamĉeloj (HSC-oj) per la malaktiviga vojo. Ĉi tiuj rezultoj malkaŝas novan rolon por IPA, igante ĝin ebla terapia celo por antaŭenigi regreson de hepata fibrozo.
Antaŭa studo en la KOBS-kohorto montris, ke pacientoj kun hepata fibrozo havis pli malaltajn cirkulantajn IPA-nivelojn kompare kun pacientoj sen hepata fibrozo [15]. Por ekskludi la eblan konfuzigan efikon de tipo 2 diabeto, ni rekrutis 116 obezajn pacientojn sen tipo 2 diabeto (meza aĝo ± SD: 46.8 ± 9.3 jaroj; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (Tabelo 1) el la daŭranta KOBS-studo kiel la studpopulacio [16]. Ĉiuj partoprenantoj donis skriban informitan konsenton kaj la studprotokolo estis aprobita de la Etikkomitato de la Norda Savo Distrikta Hospitalo laŭ la Deklaracio de Helsinko (54/2005, 104/2008 kaj 27/2010).
Specimenoj de hepata biopsio estis akiritaj dum bariatria kirurgio kaj histologie taksitaj de spertaj patologiistoj laŭ antaŭe priskribitaj kriterioj [17, 18]. La taksokriterioj estas resumitaj en Aldona Tabelo S1 kaj estis priskribitaj antaŭe [19].
Fastumaj serumaj specimenoj estis analizitaj per necelita likva kromatografio-masa spektrometrio (LC-MS) por metabolomika analizo (n = 116). Specimenoj estis analizitaj uzante UHPLC-qTOF-MS sistemon (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germanio) kiel antaŭe priskribite19. Identigo de izopropila alkoholo (IPA) baziĝis sur retentempo kaj komparo de la MS/MS spektro kun puraj normoj. La IPA signalintenseco (pintareo) estis konsiderata en ĉiuj pliaj analizoj [20].
Tuta hepata RNA-sekvencado estis farita uzante Illumina HiSeq 2500 kaj datumoj estis antaŭprilaboritaj kiel antaŭe priskribite [19, 21, 22]. Ni faris celitan diferencigan espriman analizon de transskribaĵoj influantaj mitokondrian funkcion/biogenezon uzante 1957 genojn elektitajn el la datumbazo MitoMiner 4.0 [23]. Hepata DNA-metiliga analizo estis farita uzante la Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San-Diego, Kalifornio, Usono) uzante la saman metodaron kiel antaŭe priskribite [24, 25].
Homaj hepataj stelformaj ĉeloj (LX-2) estis afable donacitaj de Profesoro Stefano Romeo kaj estis kultivitaj kaj konservitaj en DMEM/F12-medio (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Por elekti la funkcian dozon de IPA, LX-2-ĉeloj estis traktitaj per malsamaj koncentriĝoj de IPA (10 μM, 100 μM kaj 1 mM; Sigma, 220027) en DMEM/F12-medio dum 24 horoj. Plue, por esplori la kapablon de IPA inaktivigi HSC-ojn, LX-2-ĉeloj estis kuntraktitaj per 5 ng/ml TGF-β1 (R&D-sistemoj, 240-B-002/CF) kaj 1 mM IPA en serum-libera medio dum 24 horoj. Por la respondaj vehiklokontroloj, 4 nM HCL enhavanta 0.1% BSA estis uzita por TGF-β1-traktado kaj 0.05% DMSO estis uzita por IPA-traktado, kaj ambaŭ estis uzitaj kune por la kombinita traktado.
Apoptozo estis taksita uzante la FITC Annexin V Apoptozan Detektan Ilaron kun 7-AAD (Biolegend, San-Diego, Kalifornio, Usono, Katalogo-numero 640922) laŭ la instrukcioj de la fabrikanto. Mallonge, LX-2 (1 × 105 ĉeloj/puto) estis kultivitaj dumnokte en 12-putaj platoj kaj poste traktitaj per multoblaj dozoj de IPA aŭ IPA kaj TGF-β1. La sekvan tagon, flosantaj kaj adheraj ĉeloj estis kolektitaj, tripsinigitaj, lavitaj per PBS, resuspenditaj en Annexin V-liga bufro, kaj inkubaciitaj kun FITC-Annexin V kaj 7-AAD dum 15 minutoj.
Mitokondrioj en vivantaj ĉeloj estis koloritaj por oksidiga aktiveco uzante Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kalifornio). Por MTR-analizoj, LX-2-ĉeloj estis inkubaciitaj je egalaj densecoj kun IPA kaj TGF-β1. Post 24 horoj, vivantaj ĉeloj estis tripsinigitaj, lavitaj per PBS, kaj poste inkubaciitaj kun 100 μM MTR en serum-libera medio je 37 °C dum 20 minutoj kiel antaŭe priskribite [26]. Por analizo de vivaj ĉeloj, ĉelgrandeco kaj citoplasma komplekseco estis analizitaj uzante parametrojn de antaŭendisĵeto (FSC) kaj flankedisĵeto (SSC), respektive.
Ĉiuj datumoj (30 000 okazaĵoj) estis akiritaj per NovoCyte Quanteon (Agilent) kaj analizitaj per la programaro NovoExpress® 1.4.1 aŭ FlowJo V.10.
La oksigenkonsuma indico (OCR) kaj la eksterĉela acidiĝa indico (ECAR) estis mezuritaj en reala tempo uzante Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornio) ekipitan per Seahorse XF Cell Mito Stress laŭ la instrukcioj de la fabrikanto. Mallonge, 2 × 10⁴ LX-2 ĉeloj/puto estis semitaj sur XF96 ĉelkulturplatojn. Post nokta inkubacio, la ĉeloj estis traktitaj per izopropanolo (IPA) kaj TGF-β1 (Aldonaj Metodoj 1). Datenanalizo estis farita uzante la programaron Seahorse XF Wave, kiu inkluzivas la Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator. El tio, Bioenergia Sano-Indekso (BHI) estis kalkulita [27].
Totala RNA estis transskribita en cDNA. Por specifaj metodoj, vidu referencon [15]. Homaj 60S ribosomal acida proteino P0 (RPLP0) kaj ciklofilino A1 (PPIA) mRNA-niveloj estis uzitaj kiel konstituaj genkontroloj. La QuantStudio 6 pro Real-Time PCR System (Thermo Fisher, Landsmeer, Nederlando) estis uzita kun la TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) aŭ la Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), kaj relativa genekspresio-faldo estis kalkulita uzante komparajn Ct-valorciklajn parametrojn (ΔΔCt) kaj la ∆∆Ct-metodon. Detaloj pri la komenciloj estas provizitaj en Suplementaj Tabeloj S2 kaj S3.
Nuklea DNA (ncDNA) kaj mitokondria DNA (mtDNA) estis ekstraktitaj uzante la DNeasy sango- kaj histo-ilaron (Qiagen) kiel antaŭe priskribite [28]. La relativa kvanto de mtDNA estis kalkulita kalkulante la rilatumon de ĉiu cela mtDNA-regiono al la geometria meznombro de la tri nukleaj DNA-regionoj (mtDNA/ncDNA), kiel detale priskribite en Suplementaj Metodoj 2. Detaloj pri la komenciloj por mtDNA kaj ncDNA estas provizitaj en Suplementa Tabelo S4.
Vivaj ĉeloj estis koloritaj per Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kalifornio) por bildigi interĉelajn kaj intraĉelajn mitokondriajn retojn. LX-2-ĉeloj (1 × 10⁴ ĉeloj/puto) estis kultivitaj sur vitraj lameloj en respondaj vitrofundaj kulturplatoj (Ibidi GmbH, Martinsried, Germanio). Post 24 horoj, vivaj LX-2-ĉeloj estis inkubaciitaj per 100 μM MTR dum 20 minutoj je 37 °C kaj ĉelnukleoj estis koloritaj per DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) kiel antaŭe priskribite [29]. Mitokondriaj retoj estis bildigitaj uzante inversan mikroskopon Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germanio) ekipitan per konfokusa modulo Zeiss LSM 800 je 37 °C en humidigita atmosfero kun 5% CO2 uzante objektivon 63×NA 1.3. Ni akiris dek Z-seriajn bildojn por ĉiu specimenspeco. Ĉiu Z-serio enhavas 30 sekciojn, ĉiu kun dikeco de 9,86 μm. Por ĉiu specimeno, bildoj de dek malsamaj vidkampoj estis akiritaj per la programaro ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germanio), kaj analizo de mitokondria morfologio estis farita per la programaro ImageJ (v1.54d) [30, 31] laŭ la parametroj detaligitaj en Suplementaj Metodoj 3.
La ĉeloj estis fiksitaj per 2% glutaraldehido en 0.1 M fosfata bufro, sekvata de fiksado per 1% osmia tetraoksida solvaĵo (Sigma Aldrich, MO, Usono), iom post iom senakvigitaj per acetono (Merck, Darmstadt, Germanio), kaj fine enigitaj en epoksirezinon. Ultramaldikaj sekcioj estis preparitaj kaj koloritaj per 1% uranila acetato (Merck, Darmstadt, Germanio) kaj 1% plumba citrato (Merck, Darmstadt, Germanio). Ultrastrukturaj bildoj estis akiritaj uzante JEM 2100F EXII transmisian elektronan mikroskopon (JEOL Ltd, Tokio, Japanio) je akcela tensio de 80 kV.
La morfologio de LX-2-ĉeloj traktitaj per IPA dum 24 horoj estis analizita per fazkontrasta mikroskopio je 50-obla pligrandigo uzante inversan lummikroskopon Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 kaj AxioCam MRm, Jena, Germanio).
Klinikaj datumoj estis esprimitaj kiel meznombro ± norma devio aŭ mediano (interkvartila intervalo: IQR). Unudirekta variancanalizo (kontinuaj variabloj) aŭ χ²-testo (kategoriaj variabloj) estis uzitaj por kompari diferencojn inter la tri studgrupoj. La falspozitiva ofteco (FDR) estis uzita por korekti multoblan testadon, kaj genoj kun FDR < 0.05 estis konsiderataj statistike signifaj. Spearman-korelacia analizo estis uzita por korelacii CpG DNA-metiligon kun IPA-signalintenseco, kun nominalaj p-valoroj (p < 0.05) raportitaj.
Analizo de la vojoj estis farita per ret-bazita ilo por analizi genojn (WebGestalt) por 268 transskribaĵoj (nominala p < 0.01), 119 transskribaĵoj asociitaj kun mitokondrioj (nominala p < 0.05), kaj 4350 CpG-oj el 3093 hepataj transskribaĵoj, kiuj estis asociitaj kun cirkulantaj serumaj IPA-niveloj. La libere havebla ilo Venny DB (versio 2.1.0) estis uzata por trovi interkovrantajn genojn, kaj StringDB (versio 11.5) estis uzata por bildigi protein-proteinajn interagojn.
Por la eksperimento LX-2, specimenoj estis testitaj pri normaleco uzante la teston de D'Agostino-Pearson. Datumoj estis akiritaj de almenaŭ tri biologiaj ripetoj kaj submetitaj al unudirekta ANOVA kun post-hoc testo de Bonferroni. p-valoro malpli ol 0.05 estis konsiderata statistike signifa. Datumoj estas prezentitaj kiel meznombro ± norma devio, kaj la nombro de eksperimentoj estas indikita en ĉiu figuro. Ĉiuj analizoj kaj grafikaĵoj estis faritaj uzante la statistikan programaron GraphPad Prism 8 por Vindozo (GraphPad Software Inc., versio 8.4.3, San-Diego, Usono).
Unue, ni esploris la asocion de serumaj IPA-niveloj kun hepataj, tutkorpaj kaj mitokondriaj transskribaĵoj. En la totala transskribaĵprofilo, la plej forta geno asociita kun serumaj IPA-niveloj estis MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; mitogen-aktivigita proteinkinazo-aktivigita proteinkinazo 3); en la mitokondri-rilata transskribaĵprofilo, la plej forta asociita geno estis AKT1 (FDR = 0.7621; AKT-serino/treonina kinazo 1) (Plia dosiero 1 kaj Aldona dosiero 2).
Ni poste analizis tutmondajn transskribaĵojn (n = 268; p < 0,01) kaj mitokondrio-asociitajn transskribaĵojn (n = 119; p < 0,05), finfine identigante apoptozon kiel la plej signifan kanonikan vojon (p = 0,0089). Por mitokondriaj transskribaĵoj asociitaj kun serumaj IPA-niveloj, ni fokusiĝis al apoptozo (FDR = 0,00001), mitofagio (FDR = 0,00029), kaj TNF-signalaj vojoj (FDR = 0,000006) (Figuro 1A, Tabelo 2, kaj Aldonaj Figuroj 1A-B).
Interkovranta analizo de tutmondaj, mitokondrio-asociitaj transskribaĵoj, kaj DNA-metiligo en homa hepato rilate al serumaj IPA-niveloj. A reprezentas 268 tutmondajn transskribaĵojn, 119 mitokondrio-asociitajn transskribaĵojn, kaj DNA-metiligitajn transskribaĵojn, kiuj estas mapitaj al 3092 CpG-ejoj asociitaj kun serumaj IPA-niveloj (p-valoroj < 0.01 por tutmondaj transskribaĵoj kaj DNA-metiligitaj, kaj p-valoroj < 0.05 por mitokondriaj transskribaĵoj). La ĉefaj interkovrantaj transskribaĵoj estas montritaj en la mezo (AKT1 kaj YKT6). B La interaga mapo de la 13 genoj kun la plej alta interaga poentaro (0.900) kun aliaj genoj estis konstruita el la 56 interkovrantaj genoj (nigra linia regiono) kiuj estis signife asociitaj kun serumaj IPA-niveloj uzante la retan ilon StringDB. Verda: Genoj mapitaj al la ĉela komponanto de Gene Ontology (GO): mitokondrioj (GO:0005739). AKT1 estas la proteino kun la plej alta poentaro (0.900) por interagoj kun aliaj proteinoj bazitaj sur la datumoj (bazitaj sur tekstominado, eksperimentoj, datumbazoj kaj kunesprimo). Retnodoj reprezentas proteinojn, kaj randoj reprezentas konektojn inter proteinoj.
Ĉar metabolitoj de intesta mikrobioto povas reguligi epigenetikan konsiston per DNA-metiligo [32], ni esploris ĉu serumaj IPA-niveloj estis asociitaj kun hepata DNA-metiligo. Ni trovis, ke la du ĉefaj metiligaj lokoj asociitaj kun serumaj IPA-niveloj estis proksime al prolin-serino-riĉa regiono 3 (C19orf55) kaj varmoŝoka proteina familio B (malgranda) membro 6 (HSPB6) (Plia dosiero 3). DNA-metiligo de 4350 CpG (p < 0.01) estis korelaciita kun serumaj IPA-niveloj kaj estis riĉigita en longvivecaj reguligaj vojoj (p = 0.006) (Figuro 1A, Tabelo 2, kaj Aldona Figuro 1C).
Por kompreni la biologiajn mekanismojn subestantajn la asociojn inter serumaj IPA-niveloj, tutmondaj transskribaĵoj, mitokondrio-asociitaj transskribaĵoj, kaj DNA-metiligo en homa hepato, ni faris interkovran analizon de la genoj identigitaj en la antaŭa vojanalizo (Figuro 1A). La rezultoj de la vojriĉiga analizo de la 56 interkovrantaj genoj (ene de la nigra linio en Figuro 1A) montris, ke la apoptoza vojo (p = 0.00029) elstarigis du genojn komunajn al la tri analizoj: AKT1 kaj YKT6 (YKT6 v-SNARE homologo), kiel montrite en la Venn-diagramo (Aldona Figuro 2 kaj Figuro 1A). Interese, ni trovis, ke AKT1 (cg19831386) kaj YKT6 (cg24161647) estis pozitive korelaciitaj kun serumaj IPA-niveloj (Aldona dosiero 3). Por identigi eblajn proteinajn interagojn inter genaj produktoj, ni elektis 13 genojn kun la plej alta komuna regiona poentaro (0.900) inter 56 interkovrantaj genoj kiel enigaĵon kaj konstruis interagan mapon. Laŭ la konfidnivelo (marĝena konfido), la AKT1-geno kun la plej alta poentaro (0,900) estis ĉe la supro (Figuro 1B).
Surbaze de la analizo de la ĉelvojoj, ni trovis, ke apoptozo estis la ĉefa vojo, do ni esploris ĉu IPA-traktado influus la apoptozon de HSC-oj in vitro. Ni antaŭe montris, ke malsamaj dozoj de IPA (10 μM, 100 μM, kaj 1 mM) estis netoksaj por LX-2-ĉeloj [15]. Ĉi tiu studo montris, ke IPA-traktado je 10 μM kaj 100 μM pliigis la nombron de vivkapablaj kaj nekrozaj ĉeloj. Tamen, kompare kun la kontrolgrupo, ĉelvivebleco malpliiĝis je 1 mM IPA-koncentriĝo, dum la ĉelnekroza ofteco restis senŝanĝa (Figuro 2A, B). Poste, por trovi la optimuman koncentriĝon por indukti apoptozon en LX-2-ĉeloj, ni testis 10 μM, 100 μM, kaj 1 mM IPA dum 24 horoj (Figuro 2A-E kaj Suplementa Figuro 3A-B). Interese, IPA 10 μM kaj 100 μM malpliigis la apoptozan indicon (%), tamen IPA 1 mM pliigis malfruan apoptozon kaj apoptozan indicon (%) kompare kun kontrolo kaj tial estis elektita por pliaj eksperimentoj (Figuroj 2A-D).
IPA induktas apoptozon de LX-2-ĉeloj. La duobla kolorigmetodo de Aneksino V kaj 7-AAD estis uzata por kvantigi la apoptozan indicon kaj ĉelan morfologion per fluocitometrio. BA-ĉeloj estis inkubaciitaj kun 10 μM, 100 μM kaj 1 mM IPA dum 24 horoj aŭ kun F–H TGF-β1 (5 ng/ml) kaj 1 mM IPA en serum-libera medio dum 24 horoj. A: vivantaj ĉeloj (Annexin V -/ 7AAD-); B: nekrozaj ĉeloj (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: frua (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: malfrua (Annexin V+/7AAD.+); E, H: procento de totalaj fruaj kaj malfruaj apoptotaj ĉeloj en apoptoza indico (%). Datumoj estas esprimitaj kiel meznvaloro ± norma devio, n = 3 sendependaj eksperimentoj. Statistikaj komparoj estis faritaj uzante unudirektan ANOVA kun Bonferroni-post-hoc testo. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Kiel ni jam montris antaŭe, 5 ng/ml TGF-β1 povas indukti HSC-aktivigon per pliigo de la esprimo de klasikaj markilaj genoj [15]. LX-2-ĉeloj estis traktitaj per 5 ng/ml TGF-β1 kaj 1 mM IPA en kombinaĵo (Fig. 2E–H). TGF-β1-traktado ne ŝanĝis la apoptozan indicon, tamen, IPA-kuntraktado pliigis malfruan apoptozon kaj apoptozan indicon (%) kompare kun TGF-β1-traktado (Fig. 2E–H). Ĉi tiuj rezultoj indikas, ke 1 mM IPA povas antaŭenigi apoptozon en LX-2-ĉeloj sendepende de TGF-β1-indukto.
Ni plue esploris la efikon de IPA sur mitokondrian spiradon en LX-2-ĉeloj. La rezultoj montris, ke 1 mM IPA malpliigis la parametrojn de la oksigenkonsuma indico (OCR): ne-mitokondria spirado, baza kaj maksimuma spirado, protona elfluo kaj ATP-produktado kompare kun la kontrolgrupo (Figuro 3A, B), dum la bioenergia sanindekso (BHI) ne ŝanĝiĝis.
IPA reduktas mitokondrian spiradon en LX-2-ĉeloj. La mitokondria spiradkurbo (OCR) estas prezentita kiel mitokondriaj spiradparametroj (ne-mitokondria spirado, baza spirado, maksimuma spirado, protona elfluo, ATP-generado, SRC kaj BHI). Ĉeloj A kaj B estis inkubaciitaj kun 10 μM, 100 μM kaj 1 mM IPA dum 24 horoj, respektive. Ĉeloj C kaj D estis inkubaciitaj kun TGF-β1 (5 ng/ml) kaj 1 mM IPA en serum-libera medio dum 24 horoj, respektive. Ĉiuj mezuradoj estis normaligitaj al DNA-enhavo uzante la CyQuant-ilaron. BHI: bioenergia sanindekso; SRC: spira rezerva kapacito; OCR: oksigenkonsuma indico. Datumoj estas prezentitaj kiel meznombro ± norma devio (SD), n = 5 sendependaj eksperimentoj. Statistikaj komparoj estis faritaj uzante unudirektan ANOVA kaj Bonferroni-post-hoc teston. *p < 0.05; **p < 0.01; kaj ***p < 0.001
Por akiri pli ampleksan komprenon pri la efiko de IPA sur la bioenergia profilo de TGF-β1-aktivigitaj LX-2 ĉeloj, ni analizis mitokondrian oksidativan fosforiladon per OCR (Fig. 3C,D). La rezultoj montris, ke TGF-β1-traktado povus redukti la maksimuman spiradon, spiran rezervan kapaciton (SRC) kaj BHI kompare kun la kontrolgrupo (Fig. 3C,D). Krome, la kombinita traktado malpliigis bazan spiradon, protonan elfluon kaj ATP-produktadon, sed SRC kaj BHI estis signife pli altaj ol tiuj traktitaj per TGF-β1 (Fig. 3C,D).
Ni ankaŭ plenumis la "Teston de Ĉela Energio-Fenotipo" provizitan de la programaro Seahorse (Aldona Figuro 4A-D). Kiel montrite en Aldona Figuro 3B, kaj la metabolaj potencialoj de OCR kaj ECAR malpliiĝis post la traktado per TGF-β1, tamen neniu diferenco estis observita en la kombinitaj kaj IPA-traktadgrupoj kompare kun la kontrolgrupo. Krome, kaj la bazaj kaj stresaj niveloj de OCR malpliiĝis post la kombinita kaj IPA-traktado kompare kun la kontrolgrupo (Aldona Figuro 4C). Interese, simila ŝablono estis observita kun kombina terapio, kie neniu ŝanĝo en la bazaj kaj stresaj niveloj de ECAR estis observita kompare kun TGF-β1-traktado (Aldona Figuro 4C). En HSC-oj, la redukto de mitokondria oksidativa fosforiligo kaj la kapablo de kombinita traktado restarigi SCR kaj BHI post eksponiĝo al TGF-β1-traktado ne ŝanĝis la metabolan potencialon (OCR kaj ECAR). Sume, ĉi tiuj rezultoj indikas, ke IPA povus redukti bioenergetikon en HSC-oj, sugestante, ke IPA povus indukti pli malaltan energian profilon, kiu ŝanĝas la HSC-fenotipon al malaktivigo (Suplementa Figuro 4D).
La efiko de IPA sur mitokondrian dinamikon estis esplorita uzante tridimensian kvantigon de mitokondria morfologio kaj retkonektoj same kiel MTR-kolorigon (Figuro 4 kaj Aldona Figuro 5). Figuro 4 montras, ke kompare kun la kontrolgrupo, TGF-β1-traktado malpliigis la mezan surfacareon, branĉnombron, totalan branĉlongon kaj branĉkrucnombron (Figuro 4A kaj B) kaj ŝanĝis la proporcion de mitokondrioj de sfera al meza morfologio (Figuro 4C). Nur IPA-traktado malpliigis la mezan mitokondrian volumenon kaj ŝanĝis la proporcion de mitokondrioj de sfera al meza morfologio kompare kun la kontrolgrupo (Figuro 4A). Kontraste, sfereco, meza branĉlongo kaj mitokondria aktiveco taksitaj per mitokondria membranpotencial-dependa MTR (Figuro 4A kaj E) restis senŝanĝaj kaj ĉi tiuj parametroj ne diferencis inter grupoj. Kune, ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke TGF-β1 kaj IPA-traktado ŝajnas moduli mitokondrian formon kaj grandecon same kiel retkompleksecon en vivantaj LX-2-ĉeloj.
IPA ŝanĝas mitokondrian dinamikon kaj abundon de mitokondria DNA en LX-2-ĉeloj. A. Reprezentaj konfokusaj bildoj de vivaj LX-2-ĉeloj inkubitaj kun TGF-β1 (5 ng/ml) kaj 1 mM IPA dum 24 horoj en serum-libera medio, montrantaj mitokondriajn retojn makulitajn per Mitotracker™ Red CMXRos kaj nukleojn makulitajn blue per DAPI. Ĉiuj datumoj enhavis almenaŭ 15 bildojn por grupo. Ni akiris 10 Z-stakajn bildojn por ĉiu specimena tipo. Ĉiu Z-aksa sekvenco enhavis 30 tranĉaĵojn, ĉiu kun dikeco de 9.86 μm. Skalbreto: 10 μm. B. Reprezentaj objektoj (nur mitokondrioj) identigitaj per apliko de adapta sojlado al la bildo. Kvanta analizo kaj komparo de mitokondriaj morfologiaj retkonektoj estis faritaj por ĉiuj ĉeloj en ĉiu grupo. C. Ofteco de mitokondriaj formproporcioj. Valoroj proksimaj al 0 indikas sferajn formojn, kaj valoroj proksimaj al 1 indikas filamentecajn formojn. D La enhavo de mitokondria DNA (mtDNA) estis determinita kiel priskribite en Materialoj kaj Metodoj. Analizo de E Mitotracker™ Red CMXRos estis farita per fluocitometrio (30 000 eventoj) kiel priskribite en Materialoj kaj Metodoj. Datumoj estas prezentitaj kiel meznombro ± norma devio, n = 3 sendependaj eksperimentoj. Statistikaj komparoj estis faritaj uzante unudirektan ANOVA kaj Bonferroni-post-hoc teston. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Ni poste analizis la mtDNA-enhavon en LX-2-ĉeloj kiel indikilon de mitokondria nombro. Kompare kun la kontrolgrupo, la mtDNA-enhavo estis pliigita en la TGF-β1-traktita grupo (Figuro 4D). Kompare kun la TGF-β1-traktita grupo, la mtDNA-enhavo estis malpliigita en la kombinita traktado-grupo (Figuro 4D), sugestante ke IPA povus redukti la mtDNA-enhavon kaj eble la mitokondrian nombron same kiel mitokondrian spiradon (Figuro 3C). Krome, IPA ŝajnis redukti la mtDNA-enhavon en la kombinita traktado sed ne influis MTR-mediaciitan mitokondrian agadon (Figuroj 4A-C).
Ni esploris la asocion de IPA kun la mRNA-niveloj de genoj asociitaj kun fibrozo, apoptozo, supervivo kaj mitokondria dinamiko en LX-2-ĉeloj (Figuro 5A-D). Kompare kun la kontrolgrupo, la TGF-β1-traktita grupo montris pliigitan esprimon de genoj kiel kolagena tipo I α2-ĉeno (COL1A2), α-glata muskola aktino (αSMA), matriksa metaloproteinazo 2 (MMP2), hista inhibiciilo de metaloproteinazo 1 (TIMP1), kaj dinamin-1-simila geno (DRP1), indikante pliigitan fibrozon kaj aktivigon. Krome, kompare kun la kontrolgrupo, TGF-β1-traktado reduktis la mRNA-nivelojn de nuklea pregnano X-receptoro (PXR), kaspazo 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibiciilo de B-ĉela α, plifortigilo de nuklea faktoro κ gena lumpeptido (NFκB1A), kaj inhibiciilo de nuklea faktoro κB kinaza subunuo β (IKBKB) (Figuro 5A-D). Kompare kun TGF-β1-traktado, kombinita traktado kun TGF-β1 kaj IPA reduktis la esprimon de COL1A2 kaj MMP2, sed pliigis la mRNA-nivelojn de PXR, TIMP1, B-ĉela limfomo-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, kaj IKBKB. IPA-traktado signife malpliigis la esprimon de MMP2, Bcl-2-asociita proteino X (BAX), AKT1, optika atrofia proteino 1 (OPA1), kaj mitokondria fuzia proteino 2 (MFN2), dum la esprimo de CASP8, NFκB1A, NFκB1B, kaj IKBKB estis pliigita kompare kun la kontrolgrupo. Tamen, neniu diferenco estis trovita en la esprimo de kaspazo-3 (CASP3), apoptota peptidaza aktiviga faktoro 1 (APAF1), mitokondria fuzia proteino 1 (MFN1), kaj fisioproteino 1 (FIS1). Sume, ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke IPA-traktado modulas la esprimon de genoj asociitaj kun fibrozo, apoptozo, postvivado kaj mitokondria dinamiko. Niaj datumoj sugestas, ke IPA-traktado reduktas fibrozon en LX-2-ĉeloj; samtempe, ĝi stimulas postvivadon ŝanĝante la fenotipon al malaktivigo.
IPA modulas la esprimon de fibroblastaj, apoptotaj, viveblecaj kaj mitokondriaj dinamikaj genoj en LX-2-ĉeloj. Histogramoj montras mRNA-esprimon relative al endogena kontrolo (RPLP0 aŭ PPIA) post kiam LX-2-ĉeloj estis induktitaj per TGF-β1 kaj IPA en serum-libera medio dum 24 horoj. A indikas fibroblastojn, B indikas apoptotajn ĉelojn, C indikas postvivantajn ĉelojn, kaj D indikas mitokondrian dinamikan genan esprimon. Datumoj estas prezentitaj kiel meznombro ± norma devio (SD), n = 3 sendependaj eksperimentoj. Statistikaj komparoj estis faritaj uzante unudirektan ANOVA kaj Bonferroni-post-hoc teston. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Poste, ŝanĝoj en ĉelgrandeco (FSC-H) kaj citoplasma komplekseco (SSC-H) estis taksitaj per fluocitometrio (Figuro 6A,B), kaj ŝanĝoj en ĉelmorfologio post IPA-traktado estis taksitaj per transmisia elektrona mikroskopio (TEM) kaj fazkontrasta mikroskopio (Aldona Figuro 6A-B). Kiel atendite, ĉeloj en la TGF-β1-traktita grupo pligrandiĝis kompare kun la kontrolgrupo (Figuro 6A,B), montrante la klasikan ekspansion de malglata endoplasma retikulo (ER*) kaj fagolizozomoj (P), indikante aktivigon de hematopoezaj stamĉeloj (HSC) (Aldona Figuro 6A). Tamen, kompare kun la TGF-β1-traktita grupo, la ĉelgrandeco, citoplasma komplekseco (Fig. 6A,B), kaj ER*-enhavo malpliiĝis en la TGF-β1 kaj IPA-kombinaĵa traktado-grupo (Aldona Figuro 6A). Krome, IPA-traktado malpliigis la ĉelgrandecon, citoplasman kompleksecon (Fig. 6A,B), P kaj ER*-enhavon (Aldona Fig. 6A) kompare kun la kontrolgrupo. Krome, la enhavo de apoptotaj ĉeloj pliiĝis post 24 horoj da IPA-traktado kompare kun la kontrolgrupo (blankaj sagoj, Aldona Fig. 6B). Kolektive, ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke 1 mM IPA povas stimuli HSC-apoptozon kaj inversigi la ŝanĝojn en ĉelmorfologiaj parametroj induktitaj de TGF-β1, tiel reguligante la ĉelgrandecon kaj kompleksecon, kiuj povas esti asociitaj kun HSC-inaktivigo.
IPA ŝanĝas ĉelgrandecon kaj citoplasman kompleksecon en LX-2-ĉeloj. Reprezentaj bildoj de fluocitometria analizo. La analizo uzis enkurvigan strategion specifan por LX-2-ĉeloj: SSC-A/FSC-A por difini la ĉelpopulacion, FSC-H/FSC-A por identigi duoblojn, kaj SSC-H/FSC-H por ĉelgrandeco kaj kompleksecoanalizo. Ĉeloj estis inkubaciitaj kun TGF-β1 (5 ng/ml) kaj 1 mM IPA en serum-libera medio dum 24 horoj. LX-2-ĉeloj estis distribuitaj en malsupran maldekstran kvadranton (SSC-H-/FSC-H-), supran maldekstran kvadranton (SSC-H+/FSC-H-), malsupran dekstran kvadranton (SSC-H-/FSC-H+), kaj supran dekstran kvadranton (SSC-H+/FSC-H+) por ĉelgrandeco kaj citoplasma kompleksecoanalizo. B. Ĉelmorfologio estis analizita per fluocitometrio uzante FSC-H (antaŭa disĵeto, ĉelgrandeco) kaj SSC-H (flanka disĵeto, citoplasma komplekseco) (30 000 okazaĵoj). Datumoj estas prezentitaj kiel meznombro ± norma devio, n = 3 sendependaj eksperimentoj. Statistikaj komparoj estis faritaj uzante unudirektan ANOVA kaj Bonferroni-post-hoc teston. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 kaj ****p < 0,0001
Intestaj metabolitoj kiel IPA fariĝis varmega esplortemo, sugestante ke novaj celoj povus esti malkovritaj en la intesta mikrobioto. Tial estas interese, ke IPA, metabolito, kiun ni ligis al hepata fibrozo ĉe homoj [15], montriĝis esti ebla kontraŭfibroza kombinaĵo en bestaj modeloj [13, 14]. Ĉi tie, ni montras por la unua fojo asocion inter seruma IPA kaj tutmonda hepata transkriptomiko kaj DNA-metiligo ĉe obesaj individuoj sen tipo 2 diabeto (T2D), elstarigante apoptozon, mitofagion kaj longvivecon, same kiel eblan kandidatgenon AKT1 reguligantan hepatan homeostazon. Alia novaĵo de nia studo estas, ke ni montris la interagadon de IPA-traktado kun apoptozo, ĉelmorfologio, mitokondria bioenergetiko kaj dinamiko en LX-2-ĉeloj, indikante pli malaltan energian spektron, kiu ŝovas la HSC-fenotipon al inaktivigo, igante IPA ebla kandidato por plibonigo de hepata fibrozo.
Ni trovis, ke apoptozo, mitofagio kaj longviveco estis la plej gravaj kanonikaj vojoj riĉigitaj per hepataj genoj asociitaj kun cirkulanta seruma IPA. Perturbo de la mitokondria kvalito-kontrola (MQC) sistemo povas konduki al mitokondria misfunkcio, mitofagio kaj apoptozo, tiel antaŭenigante la okazon de MASLD [33, 34]. Tial, ni povas konjekti, ke IPA eble partoprenas en la konservado de ĉela dinamiko kaj mitokondria integreco per apoptozo, mitofagio kaj longviveco en la hepato. Niaj datumoj montris, ke du genoj estis komunaj tra la tri provoj: YKT6 kaj AKT1. Indas rimarki, ke YKT6 estas SNARE-proteino implikita en la procezo de ĉelmembrana fuzio. Ĝi ludas rolon en aŭtofagio kaj mitofagio per formado de inica komplekso kun STX17 kaj SNAP29 sur la aŭtofagosomo, tiel antaŭenigante la fuzion de aŭtofagosomoj kaj lizozomoj [35]. Krome, perdo de YKT6-funkcio rezultas en difektita mitofagio[36], dum suprenregulado de YKT6 estas asociita kun la progresado de hepatoĉela karcinomo (HCC), montrante pliigitan ĉelan supervivon[37]. Aliflanke, AKT1 estas la plej grava interaganta geno kaj ludas gravan rolon en hepataj malsanoj, inkluzive de la PI3K/AKT-signalvojo, ĉelciklo, ĉelmigrado, proliferado, fokusa adhero, mitokondria funkcio kaj kolagena sekrecio[38–40]. Aktivigita PI3K/AKT-signalvojo povas aktivigi hematopoezajn stamĉelojn (HSC-ojn), kiuj estas la ĉeloj respondecaj pri la produktado de eksterĉela matrico (ECM), kaj ĝia disregulado povas kontribui al la okazo kaj progresado de hepata fibrozo[40]. Krome, AKT estas unu el la ŝlosilaj ĉelsupervivaj faktoroj, kiu inhibicias p53-dependan ĉelan apoptozon, kaj AKT-aktivigo povas esti asociita kun la inhibicio de hepatĉela apoptozo[41, 42]. La akiritaj rezultoj sugestas, ke IPA povas esti implikita en hepata mitokondrio-rilata apoptozo per influado de la decido de hepatocitoj inter eniri apoptozon aŭ supervivon. Tiujn efikojn povas reguligi AKT kaj/aŭ YKT6 kandidatgenoj, kiuj estas kritikaj por hepata homeostazo.
Niaj rezultoj montris, ke 1 mM IPA induktis apoptozon kaj malpliigis mitokondrian spiradon en LX-2-ĉeloj sendepende de TGF-β1-traktado. Rimarkinde, apoptozo estas grava vojo por fibrozo-rezolucio kaj hematopoezaj stamĉeloj (HSC-aktivigo), kaj ankaŭ estas ŝlosila evento en la reigebla fiziologia respondo de hepata fibrozo [4, 43]. Krome, la restarigo de BHI en LX-2-ĉeloj post kombinita traktado provizis novajn komprenojn pri la ebla rolo de IPA en la reguligo de mitokondria bioenergetiko. Sub ripozaj kaj neaktivaj kondiĉoj, hematopoezaj ĉeloj normale uzas mitokondrian oksidativan fosforiligon por produkti ATP kaj havas malaltan metabolan agadon. Aliflanke, HSC-aktivigo plibonigas mitokondrian spiradon kaj biosintezon por kompensi la energiajn bezonojn de eniro en la glikolizan staton [44]. La fakto, ke IPA ne influis la metabolan potencialon kaj ECAR, sugestas, ke la glikoliza vojo estas malpli prioritata. Simile, alia studo montris, ke 1 mM IPA kapablis moduli la aktivecon de la mitokondria spira ĉeno en kardiomiocitoj, homa hepatocita ĉellinio (Huh7) kaj homaj umbilikaj vejnaj endotelaj ĉeloj (HUVEC); Tamen, neniu efiko de IPA estis trovita sur glikolizo en kardiomiocitoj, sugestante, ke IPA povus influi la bioenergetikon de aliaj ĉeltipoj [45]. Tial, ni konjektas, ke 1 mM IPA povus agi kiel milda kemia malkuplanto, ĉar ĝi povas signife redukti fibrogenan genekspresion, ĉelmorfologion kaj mitokondrian bioenergetikon sen ŝanĝi la kvanton de mtDNA [46]. Mitokondriaj malkuplantoj povas inhibicii kultur-induktitan fibrozon kaj HSC-aktivigon [47] kaj redukti mitokondrian ATP-produktadon reguligitan aŭ induktitan de certaj proteinoj kiel malkuplaj proteinoj (UCP) aŭ adenina nukleotida translokazo (ANT). Depende de la ĉeltipo, ĉi tiu fenomeno povas protekti ĉelojn kontraŭ apoptozo kaj/aŭ antaŭenigi apoptozon [46]. Tamen, pliaj studoj estas necesaj por pliklarigi la rolon de IPA kiel mitokondria malkuplanto en hematopoezaj stamĉeloj malaktivigo.
Ni poste esploris ĉu la ŝanĝoj en mitokondria spirado estas reflektitaj en mitokondria morfologio en vivantaj LX-2-ĉeloj. Interese, TGF-β1-traktado ŝanĝas la mitokondrian proporcion de sfera al meza, kun malpliiĝinta mitokondria branĉiĝo kaj pliigita esprimo de DRP1, ŝlosila faktoro en mitokondria fisio [48]. Krome, mitokondria fragmentiĝo estas asociita kun ĝenerala retkomplekseco, kaj la transiro de fuzio al fisio estas kritika por hematopoezaj stamĉeloj (HSC) aktivigo, dum inhibicio de mitokondria fisio kondukas al HSC-apoptozo [49]. Tiel, niaj rezultoj indikas, ke TGF-β1-traktado povas indukti malpliiĝon de mitokondria retkomplekseco kun malpliiĝinta branĉiĝo, kio estas pli ofta en mitokondria fisio asociita kun aktivigitaj hematopoezaj stamĉeloj (HSC-oj). Krome, niaj datumoj montris, ke IPA povus ŝanĝi la proporcion de mitokondrioj de sfera al meza formo, tiel reduktante la esprimon de OPA1 kaj MFN2. Studoj montris, ke malsuprenreguligo de OPA1 povus kaŭzi malpliiĝon de mitokondria membrana potencialo kaj ekigi ĉelan apoptozon [50]. MFN2 estas konata pro mediacio de mitokondria fuzio kaj apoptozo [51]. La akiritaj rezultoj sugestas, ke indukto de LX-2-ĉeloj fare de TGF-β1 kaj/aŭ IPA ŝajnas moduli mitokondrian formon kaj grandecon, same kiel aktivigan staton kaj retkompleksecon.
Niaj rezultoj indikas, ke la kombinita traktado de TGFβ-1 kaj IPA povus redukti mtDNA kaj ĉelmorfologiajn parametrojn per reguligo de la mRNA-esprimo de fibrozo, apoptozo kaj superviv-rilataj genoj en apoptozo-evitantaj ĉeloj. Efektive, IPA malpliigis la mRNA-esprimnivelon de AKT1 kaj gravaj fibrozogenoj kiel COL1A2 kaj MMP2, sed pliigis la esprimnivelon de CASP8, kiu estas asociita kun apoptozo. Niaj rezultoj montris, ke post IPA-traktado, BAX-esprimo malpliiĝis kaj mRNA-esprimo de TIMP1-familiaj subunuoj, BCL-2 kaj NF-κB pliiĝis, sugestante, ke IPA povus stimuli supervivajn signalojn en hematopoezaj stamĉeloj (HSC-oj), kiuj evitas apoptozon. Ĉi tiuj molekuloj povas agi kiel por-supervivaj signaloj en aktivigitaj hematopoezaj stamĉeloj, kiuj povas esti asociitaj kun pliigita esprimo de kontraŭ-apoptotaj proteinoj (kiel Bcl-2), malpliigita esprimo de pro-apoptota BAX, kaj kompleksa interagado inter TIMP kaj NF-κB [5, 7]. IPA efikas per PXR, kaj ni trovis, ke kombinita traktado kun TGF-β1 kaj IPA pliigis la nivelojn de esprimo de PXR mRNA, indikante subpremadon de HSC-aktivigo. Aktivigita PXR-signalado estas konata kiel inhibiciado de HSC-aktivigo kaj in vivo kaj in vitro [52, 53]. Niaj rezultoj indikas, ke IPA povas partopreni en la forigo de aktivigitaj HSC-oj per antaŭenigado de apoptozo, reduktado de fibrozo kaj mitokondria metabolo, kaj plibonigado de supervivaj signaloj, kiuj estas tipaj procezoj, kiuj konvertas la aktivigitan HSC-fenotipon al inaktivigita. Alia ebla klarigo por la ebla mekanismo kaj rolo de IPA en apoptozo estas, ke ĝi forigas misfunkciajn mitokondriojn ĉefe per mitofagio (interna vojo) kaj la ekstera TNF-signala vojo (Tabelo 1), kiu estas rekte ligita al la NF-κB-superviva signala vojo (Aldona Figuro 7). Interese, IPA-rilataj riĉigitaj genoj kapablas indukti proapoptozajn kaj prosupervivajn signalojn en la apoptoza vojo [54], sugestante ke IPA povus indukti la apoptozan vojon aŭ supervivon per interagado kun ĉi tiuj genoj. Tamen, kiel IPA induktas apoptozon aŭ supervivon dum HSC-aktivigo kaj ĝiaj mekanismaj vojoj restas neklaraj.
IPA estas mikroba metabolito formita el manĝtriptofano per la intesta mikrobioto. Studoj montris, ke ĝi havas kontraŭinflamatoriajn, antioksidajn kaj epigenetikajn reguligajn ecojn en la intesta medio.[55] Studoj montris, ke IPA povas moduli intestan barierfunkcion kaj redukti oksidativan streson, kio povas kontribui al ĝiaj lokaj fiziologiaj efikoj.[56] Fakte, IPA estas transportata al celaj organoj per la cirkulado, kaj ĉar IPA dividas similan ĉefan metabolitan strukturon kun triptofano, serotonino kaj indolaj derivaĵoj, IPA penas metabolajn agojn, rezultante en konkurencaj metabolaj sortoj.[52] IPA povas konkuri kun triptofan-derivitaj metabolitoj pri liglokoj sur enzimoj aŭ receptoroj, eble interrompante normalajn metabolajn vojojn. Ĉi tio elstarigas la bezonon de pliaj studoj pri ĝia farmakokinetiko kaj farmakodinamiko por pli bone kompreni ĝian terapian fenestron.[57] Restas vidi, ĉu ĉi tio ankaŭ povas okazi en hematopoezaj stamĉeloj (HSC-oj).
Ni agnoskas, ke nia studo havas kelkajn limigojn. Por specife ekzameni asociojn rilatajn al IPA, ni ekskludis pacientojn kun tipo 2 diabeto (T2DM). Ni agnoskas, ke tio limigas la larĝan aplikeblecon de niaj trovoj al pacientoj kun tipo 2 diabeto kaj progresinta hepatmalsano. Kvankam la fiziologia koncentriĝo de IPA en homa serumo estas 1–10 μM [11, 20], koncentriĝo de 1 mM IPA estis elektita surbaze de la plej alta netoksa koncentriĝo [15] kaj la plej alta indico de apoptozo, sen diferenco en la procento de la nekroza ĉelpopulacio. Kvankam suprafiziologiaj niveloj de IPA estis uzitaj en ĉi tiu studo, nuntempe ne ekzistas konsento pri la efika dozo de IPA [52]. Kvankam niaj rezultoj estas signifaj, la pli larĝa metabola sorto de IPA restas aktiva esplora areo. Krome, niaj trovoj pri la asocio inter serumaj IPA-niveloj kaj DNA-metiligo de hepataj transskribaĵoj estis akiritaj ne nur de hematopoezaj stamĉeloj (HSC-oj), sed ankaŭ de hepataj histoj. Ni elektis uzi homajn LX-2-ĉelojn surbaze de niaj antaŭaj trovoj de transkriptoma analizo, ke IPA estas asociita kun aktivigo de hematopoezaj stamĉeloj (HSC) [15], kaj HSC-oj estas la ĉefaj ĉeloj implikitaj en la progresado de hepata fibrozo. La hepato konsistas el pluraj ĉeltipoj, do aliaj ĉelmodeloj kiel hepatocito-HSC-imuna ĉelkun-kultura sistemo kombinita kun kaspaza aktivigo kaj DNA-fragmentiĝo, same kiel la mekanismo de ago inkluzive de proteina nivelo, devus esti konsiderataj por studi la rolon de IPA kaj ĝian interagadon kun aliaj hepataj ĉeltipoj.