Proteina ordigo en la sekrecia vojo estas esenca por konservi ĉelan kompartmentigon kaj homeostazon. Aldone al ŝel-mediaciita ordigo, la rolo de lipidoj en kinezina ordigo en la procezo de sekrecia transporto estas delonga baza demando, kiu ankoraŭ ne estas respondita. Ĉi tie, ni faras 3D samtempan multkoloran alt-rezolucian realtempan bildigon por pruvi in ​​vivo, ke nove sintezitaj glikosilfosfatidilinozitol-imobilizitaj proteinoj kun tre longaj ceramidaj lipidaj partoj estas grupigitaj kaj klasifikitaj en specialigitajn endoplasmajn elirejajn lokojn, kiuj diferencas de tiuj uzataj de transmembranaj proteinoj. Krome, ni montras, ke la ĉenlongo de ceramido en la endoplasmaretikula membrano estas kritika por ĉi tiu ordiga selektiveco. Nia studo provizas la unuan rektan in vivo pruvon por klasifiki proteinajn kargojn surbaze de lipidĉenlongo en selektemajn eksportlokojn en la sekrecia vojo.
En eŭkariotaj ĉeloj, la proteinoj sintezitaj en la endoplasma retikulo (ER) estas poste ordigitaj dum transporto tra la sekrecia vojo por livero al sia taŭga ĉela celloko (1). Aldone al tegaĵ-mediaciita ordigo, oni longe konjektis, ke certaj lipidoj ankaŭ povas servi kiel selektemaj elirejoj per grupigo en specifajn membranajn domajnojn por specifaj proteinoj (2-5). Tamen, ankoraŭ mankas rekta en viva evidenteco por pruvi ĉi tiun eblan lipid-bazitan mekanismon. Por solvi ĉi tiun bazan problemon, ni studis en gisto kiel glikosilfosfatidilinozitol (GPI) ankritaj proteinoj (GPI-AP-oj) estas malsame eksportitaj el la ER. GPI-AP-oj estas vario de lipid-konektitaj ĉelsurfacaj proteinoj (6, 7). GPI-AP estas sekreciita proteino ligita al la eksteraj folietoj de la plasmomembrano per la glikolipida parto (GPI-ankro). Ili akceptas GPI-ankrojn kiel konservativajn post-tradukajn modifojn en la ER-kavaĵo (8). Post alligo, GPI-AP pasas tra la Golgi-aparato (5, 9) de la ER al la plasmomembrano. La ĉeesto de GPI-ankroj kaŭzas, ke GPI-AP estas transportata aparte de transmembrane sekreciitaj proteinoj (inkluzive de aliaj plasmomembranaj proteinoj) laŭ la sekrecia vojo (5, 9, 10). En gistaj ĉeloj, GPI-AP-oj estas apartigitaj de aliaj sekreciitaj proteinoj en la endoplasma retikulo, kaj poste pakitaj en unikajn vezikojn envolvitajn de la kovroproteina komplekso II (COPII) (6, 7). La determinantoj de ĉi tiu klasifikprocezo en la ER-eksportprocezo estas neklaraj, sed oni konjektas, ke ĉi tiu mekanismo povus postuli lipidojn, precipe la strukturan remodeladon de la lipida parto de la GPI-ankro (5, 8). En gisto, GPI-lipida remodelado komenciĝas tuj post kiam la GPI alligas, kaj en multaj kazoj, ĝi kaŭzas, ke ceramido ligiĝas al la 26-karbona longĉena saturita grasacido (C26:0) (11, 12). C26-ceramido estas la ĉefa ceramido produktita de gistaj ĉeloj ĝis nun. Ĝi estas sintezita en la ER kaj plejparto de ĝi estas eksportita al la Golgi-aparato per COPII-vezikoj (13). La ER-eksporto de GPI-AP specife postulas daŭran ceramidsintezon (14, 15), kaj siavice, la konverto de ceramido al inozitolfosfata ceramido (IPC) en la Golgi-aparato dependas de GPI-ankrosintezo (16). Biofizikaj studoj kun artefaritaj membranoj montris, ke tre longaj acilĉenaj ceramidoj povas kunflui por formi ordigitajn domajnojn kun unikaj fizikaj ecoj (17, 18). Ĉi tiuj datumoj kondukas al la hipotezo, ke C26-ceramido kaj GPI-AP kun C26-ceramido uzas siajn fizikajn ecojn por kunflui en ordigitajn regionojn aŭ regionojn en la relative malorda ER-membranlipida medio. Ĝi konsistas ĉefe el mallongaj kaj nesaturitaj glicerolipidoj (C16:1 kaj C18:1) (19, 20). Ĉi tiuj regionoj estos selekteme enfokusigitaj al specifaj ER-elirejaj lokoj (ERES), kie ceramido kaj ceramid-bazita GPI-AP povas esti kuntransportataj al la Golgi-aparato en la sama dediĉita COPII-veziklo (5).
En ĉi tiu studo, ni rekte testis ĉi tiun lipid-bazitan mekanismon per uzado de super-rezolucia konfokusa realtempa bildiga mikroskopio (SCLIM), kiu estas pintnivela mikroskopia tekniko, kiu povas samtempe observi fluoreske markitajn proteinojn. La trikoloraj kaj tridimensiaj (3D) bildoj havas ekstreme altan rezolucion kaj rapidecon en vivantaj ĉeloj (21, 22).
Ni unue aplikis SCLIM-teknologion por plue difini kiel normala GPI-AP kun C26-ceramida grupo estis ekzamenita el transmembrane sekreciitaj proteinoj post forlaso de la ER en S. cerevisiae. Por kontroli la klasifikon de ER, ni uzis genetikan sistemon, kiu povas rekte bildigi nove sintezitan kargon enirantan ERES in vivo (7, 23). Kiel kargon, ni elektis C26-ceramid-bazitan GPI-AP Gas1 markitan per verda fluoreska proteino (GFP) kaj transmembrane sekreciitan proteinon Mid2 markitan per preskaŭ-infraruĝa fluoreska proteino (iRFP), ambaŭ celas la plasmomembranon (24-26). En la sec31-1 temperatur-sentema mutaciulo, ĉi tiuj du kargoj estas esprimitaj sub galaktoz-induktebla promotoro kaj konstitua ERES-markilo. Ĉe la ekstrema temperaturo (37°C), ĉar la sec31-1-mutacio influas la funkcion de COPII-tegmenta komponento Sec31 por inhibicii COPII-ĝermadon kaj ER-eksporton, nove sintezita kargo akumuliĝas ĉe la ER (23). Post malvarmigo ĝis malalta temperaturo (24°C), la sec31-1-mutaciaj ĉeloj resaniĝis el la sekrecia areo, kaj la akumulita nova sinteza kargo komencis esti eksportita el la ER. CLIM-bildigo montris, ke plejparto de la nove sintezita Gas1-GFP kaj Mid2-iRFP ankoraŭ akumuliĝis en la ER de la sec31-1-mutaciaj ĉeloj post inkubacio je 37°C kaj poste liberigita je 24°C dum 5 minutoj (Figuro 1). Ĉar Mid2-iRFP estas distribuita sur la tuta ER-membrano, kaj Gas1-GFP estas koncentrita kaj kolektita en la malkontinua ER-membrana areo, ilia distribuo estas tute malsama (Figuro 1, A ĝis C kaj Filmo S1). Krome, kiel montrite en Figuro 1D, la Gas1-GFP-areto ne havas Mid2-iRFP. Ĉi tiuj rezultoj indikas, ke GPI-AP kaj transmembranaj proteinoj estis frue apartigitaj en malsamajn ER-membranajn regionojn. La Gas1-GFP-areto estas apud specifa ERES markita per la COPII-kovroproteino Sec13 de mCherry (Figuro 1, E kaj F, kaj filmo S1) (23).
sec31-1 ĉeloj esprimas galaktoz-induktitajn sekreciojn, longan acilĉenan (C26) ceramidon GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, verda) kaj la transmembranan proteinon Mid2-iRFP (TMP, blua), kaj ĉi tiu konstruktiva ERES-etikedado Sec13-mCherry (ERES, magenta) estis inkubita je 37°C dum 30 minutoj, movita al 24°C, kaj bildigita per SCLIM 5 minutojn poste. (A ĝis C) montras reprezentan kunfanditan aŭ unuopan 2D-bildon de ebeno (A), 2D-projekcian bildon de 10 z-sekcioj (B) aŭ 3D-ĉelan hemisferan bildon de kargo kaj ERES-markiloj (C). Skalbreto 1μm (A kaj B). La skalunuo estas 0.551μm (C). Gas1-GFP estis detektita en diskretaj ER-regionoj aŭ aretoj, dum Mid2-iRFP estis detektita kaj distribuita tra la ER-membrano (C). (D) La grafikaĵo montras la relativan fluoreskan intensecon de Gas1-GFP kaj Mid2-iRFP en la Gas1-GFP-areto laŭ la blanka saglinio (maldekstre). AU, arbitra unuo. (E kaj F) reprezentas la 3D-bildon, kiu kombinas la markon "goods" kaj ERES. Gas1-GFP-aretoj estis detektitaj proksime al la specifa ERES. La skala unuo estas 0,551 μm. (F) La blanka solida sago markas la Gas1-GFP-areton asociitan kun ERES. La meza kaj dekstra paneloj montras la kunfanditan pligrandigitan 3D-bildon kaj rotaciitan vidon de la elektita Gas1-GFP-areto.
La proksima spaca rilato inter la Gas1-GFP-areto kaj specifa ERES indikas, ke Gas1-GFP povas eniri selektivan ERES, kio diferencas de la selektiveco uzata de Mid2-iRFP por forlasi la ER. Por trakti ĉi tiun eblecon, ni kvantigis la ERES-proporcion por nur unu aŭ du varoj (Figuro 2, A ĝis C). Ni trovis, ke plej multaj ERES (70%) enhavas nur unu tipon de kargo. La malsupra bildo de Figuro 2C montras du tipajn ekzemplojn de ERES kun nur Gas1-GFP (Figuro 1) aŭ nur Mid2-iRFP (Figuro 2). Kontraste, proksimume 20% de ERES enhavas du kargojn, kiuj interkovriĝas en la sama areo. Oni trovis, ke iuj ERES (10%) enhavis du specojn de kargo, sed ili estis izolitaj en klare malsamaj areoj. Tial, ĉi tiu statistika analizo montras, ke post kiam la ER estas eksportita, GPI-AP Gas1-GFP kaj la transmembrana kargo Mid2-iRFP estas dividitaj en malsamajn ERES (Figuro 2D). Ĉi tiu ordiga efikeco estas tre kongrua kun la antaŭa biokemia analizo (6) kaj morfologia determinado (7). Ni ankaŭ povas observi la konduton de la kvarantenita kargo eniranta ERES (Figuro 2E kaj Filmo S2). Figuro 2E montras, ke nur malgranda parto de Gas1-GFP (panelo 3) aŭ Mid2-iRFP (panelo 4) eniras la ERES de unu flanko kaj estas limigita en aparta areo. Panelo 5 de Figuro 2E montras, ke Gas1-GFP kaj Mid2-iRFP foje troviĝas en la sama ERES, sed ili eniras de malsamaj flankoj kaj estas koncentritaj en apartaj regionoj, kiuj povas reprezenti malsamajn COPII-vezikojn. Ni ankaŭ konfirmis, ke la observita apartigo kaj klasifiko de C26-ceramid-bazita GPI-AP Gas1 kiel selektema ERES estas specifa ĉar alia transmembrana sekrecia kargo, la GFP-etikedita plasmomembrana proteino Axl2 (27), montras similan konduton al Mid2-iRFP. (Bildo S1 kaj Filmo S3). La nove sintezita Axl2-GFP estas distribuita tra la ER-membrano kiel Mid2-iRFP (Figuro S1, A kaj B), kaj estas kunlokigita kun Mid2-iRFP en plej multaj ERES (Figuro S1, B ĝis D). Paneloj 1 kaj 2 de Figuro 1. S1C montras du tipajn ekzemplojn de ERES kie du transmembranaj kargoj interkovriĝas. En ĉi tiuj kazoj, ambaŭ varoj eniras ERES kune (Figuro S1E, Panelo 3 kaj Filmo S3).
La sec31-1 ĉeloj esprimantaj galaktozo-indukteblajn sekreciojn, Gas1-GFP (GPI-AP, verda) kaj Mid2-iRFP (TMP, blua) kaj konstituan ERES-etikedadon Sec13-mCherry (ERES, magenta) estis metitaj je 37°C. Post kovado dum 30 minutoj je °C, ŝovu la temperaturon al 24°C por liberigi la sekrecioblokon, kaj bildigu per SCLIM post 20 minutoj. (A ĝis C) Reprezentaj 2D projekciaj bildoj (A; skalbreto, 1μm) aŭ 3D ĉelhemisferaj bildoj (B kaj C; skala unuo, 0.456μm) de la kargo kaj 10 z-sekcioj markitaj per ERES. La malsupra panelo en (B) kaj la panelo en (C) montras prilaboritajn bildojn por montri nur la varojn ĉeestantajn en ERES (magenta) [Gas1-GFP (griza) kaj Mid2-iRFP (helblua)]. (C) Malferma sago: ERES portas nur unu pecon de kargo (1 ĝis 4). Griza sago: ERES enhavas apartigitan kargon (5). Blanka solida sago: ERES enhavanta kunlokitan kargon. Sube: La elektita unuopa ERES enhavas nur Gas1-GFP (1) aŭ Mid2-iRFP (2). Skalbreto, 100 nm. (D) Kvantigo de la mikrofoto priskribita en (C). La meza procento de ERES kiu enhavas nur unu kargon (Gas1-GFP aŭ Mid2-iRFP), apartigitan kargon kaj interkovrantan kargon. En tri sendependaj eksperimentoj, n=432 en 54 ĉeloj. Erarbreto = SD. Du-vosta nepara t-testo. *** P = 0,0002. (E) 3D-bildo de elektita ERES de kvarantenita kargo markita per (C). Gas1-GFP (verda) (3) aŭ Mid2-iRFP (blua) (4) eniras ERES (magenta) de unu flanko kaj estas limigita al malgranda areo ene de ERES. Iafoje, ambaŭ specoj de kargo eniras la saman ERES (5) de la sama flanko kaj estas limigitaj al izolita areo ene de la ERES. Skalbreto, 100 nm.
Poste, ni testis hipotezon, ke la longa acilĉena ceramido (C26) ĉeestanta en la ER-membrano pelas la specifan grupiĝon kaj ordigon de Gas1 en selektivan ERES. Por ĉi tiu celo, ni uzis modifitan gistotrostreĉon GhLag1, en kiu la du endogenaj ceramidsintezazoj Lag1 kaj Lac1 estis anstataŭigitaj per GhLag1 (la Lag1-homologo de kotono), rezultante en gistotrostreĉo kun ĉelmembrana Ceramidtrostreĉo pli mallonga ol la sovaĝa tipo (Figuro 3A) (28). Analizo per amasspektrometrio (MS) montris, ke en sovaĝtipaj trostreĉoj, 95% de la totala ceramido estas tre longa (C26) ĉena ceramido, dum en GhLag1, 85% de la ceramido estas tre longa (C18 kaj C16). ), nur 2% de la ceramido estas tre longa (C26) ĉena ceramido. Kvankam C18 kaj C16 ceramidoj estas la ĉefaj ceramidoj detektitaj en la GhLag1-membrano ĝis nun, MS-analizo ankaŭ konfirmis, ke la GPI-ankro de Gas1-GFP esprimita en la GhLag1-bakteriaro enhavas C26-ceramidon, kiu estas komparebla al sovaĝtipaj lipidoj. La kvalito estas la sama (Fig. 3A) (26). Tial, tio signifas, ke la ceramida remodeliga enzimo Cwh43 estas tre selektema por C26-ceramido, kiel montrite en Figuro 26, ĝi preferas enkorpigi la GPI-ankron el malgranda kvanto de C26-ceramido en la GhLag1-bakteriaro. S2 (29). Tamen, la ĉelmembrano de GhLag1 baze nur enhavas C18-C16-ceramidon, dum Gas1-GFP ankoraŭ havas C26-ceramidon. Ĉi tiu fakto igas ĉi tiun bredaron ideala ilo por specife solvi la problemon de la acilĉenlongo de membrana ceramido en la ER. La hipoteza rolo de klaso kaj ordigo. Poste, ni unue studis la kapablon de C26 Gas1-GFP akumuliĝi en aretoj en GhLag1 kun temperatur-sentema mutacia alelo de sec31-1 per konvencia fluoreska mikroskopio, kie nur la longa (C18-C16) ĉeno ekzistas en la ER-membrano Ceramido (Fig. 3). Ni observis, ke en sec31-1, plejparto de Gas1-GFP estis koncentrita en aretoj, dum Gas1-GFP en sec31-1 GhLag1 kun longa (C18-C16) longa ceramido ER-membrano estis plejparte ne aretita kaj distribuita en la tuta ER-membrano. Pli precize, ĉar C26-ceramid-bazita aretado estas proksime rilata al specifaj ERES (Figuro 1), ni poste esploris ĉu ĉi tiu procezo ankaŭ povus impliki la funkcion de la ER-eksporta proteina mekanismo. GPI-AP uzas specialan COPII-sistemon por ER-eksporto, kiu estas aktive reguligita per la struktura remodelado de la glikana parto de la GPI-ankro fare de Ted1 (30, 31). La rekombinita GPI-glikano estas tiam rekonata de la transmembrana kargo-receptora p24-komplekso, kiu siavice selekteme rekrutas Lst1, kiu estas specifa izoformo de la ĉefa COPII-kargo-liganta subunuo Sec24, formante GPI-AP-riĉan COPII-vezikojn. Vezikoj estas necesaj (31-33). Tial, ni konstruis duoblan mutacion, kiu kombinis la forigon de ĉi tiuj unuopaj proteinoj (la p24-kompleksa komponanto Emp24, GPI-glikana remodeliga enzimo Ted1 kaj la specifa COPII-subunuo Lst1) kun la sec31-1-mutacia trostreĉo, kaj studis ilin. Ĉu eblas formi Gas1-aretan GFP (Figuro 3)? Ni observis, ke en sec31-1emp24Δ kaj sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP estas plejparte nearetita kaj distribuita tra la ER-membrano, kiel antaŭe vidite en sec31-1 GhLag1, dum en sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP similas al sec31-1. Ĉi tiuj rezultoj indikas, ke krom la ĉeesto de C26-ceramido en la ER-membrano, la agregaciiĝo de Gas1-GFP ankaŭ devas ligiĝi al la p24-komplekso, kaj ne postulas specifan Lst1-rekrutadon. Poste, ni esploris la eblecon, ke la ĉenlongo de ceramido en la ER-membrano povas reguligi la ligadon de Gas1-GFP al p24. Tamen, ni trovis, ke la ĉeesto de C18-C16-ceramido en la membrano ne influas la GPI-glikanojn rekonstruitajn de la p24-komplekso (Figuroj S3 kaj S4, A kaj B) aŭ la ligadon al GPI-AP kaj eksportantan GPI-AP. Rekruti COPII-subtipon Lst1 (Figuro S4C). Tial, C26-ceramid-dependa agregaciiĝo ne postulas proteinajn interagojn kun malsamaj ER-eksportaj proteinaj mekanismoj, sed subtenas alternativan ordigan mekanismon pelatan de lipida longo. Poste, ni analizis ĉu la ceramida acila ĉenlongo en la ER-membrano estas grava por la efika klasifiko de Gas1-GFP kiel selektema ERES. Ĉar Gas1 en la GhLag1-bakteriaro kun mallongĉena ceramido forlasas la ER kaj eniras la plasmomembranon (Figuro S5), ni kredas, ke se la ordigo estas pelita de la longo de la ceramida acilĉeno, la Gas1 en la GhLag1-bakteriaro povas esti redirektita kaj krucigita. ERES-varoj kun la sama membrano.
(A) La ĉelmembrano de GhLag1 ĉefe enhavas pli mallongajn C18-C16 ceramidojn, dum la GPI-ankro de Gas1-GFP ankoraŭ havas la saman C26 IPC kiel sovaĝtipaj ĉeloj. Supre: analizo de la acilĉenlongo de ceramido en la ĉelmembrano de sovaĝtipaj (Wt) kaj GhLag1p trostreĉoj per masspektrometrio (MS). La datumoj reprezentas la procenton de totala ceramido. La averaĝo de tri sendependaj eksperimentoj. Erarstango = SD. Du-vosta nepara t-testo. **** P <0.0001. Malsupra panelo: MS-analizo de la acilĉenlongo de la IPC ĉeestanta en la Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI-ankro esprimita en la sovaĝtipaj kaj GhLag1p trostreĉoj. La datumoj reprezentas la procenton de totala IPC-signalo. Averaĝo de kvin sendependaj eksperimentoj. Erarstango = SD. Du-vosta nepara t-testo. ns, ne gravas. P = 0.9134. (B) Fluoreskaj mikrofotoj de sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ kaj sec31-1lst1Δ ĉeloj esprimantaj galaktoz-induktitan Gas1-GFP estis inkubaciitaj je 37°C dum 30 minutoj kaj transdonitaj malsupren al. Plenumu rutinan fluoreskan mikroskopion post 24°C. Blanka sago: ER Gas1-GFP-areto. Malferma sago: Nearetita Gas1-GFP estas distribuita sur la tuta ER-membrano, montrante la ER-karakterizan nuklean ringokoloron. Skalbreto, 5μm. (C) Kvantigo de la fotomikrografo priskribita en (B). La meza procento de ĉeloj kun punktita Gas1-GFP-strukturo. En tri sendependaj eksperimentoj, n≥300 ĉeloj. Erarbreto = SD. Du-vosta nepara t-testo. **** P <0.0001.
Por rekte solvi ĉi tiun problemon, ni efektivigis SCLIM-bildigon de Gas1-GFP kaj Mid2-iRFP en GhLag1 kun la sec31-1 temperatur-sentema mutacia alelo (Figuro 4 kaj Filmo S4). Post kiam la ER estis retenita je 37°C kaj poste liberigita je 24°C, plejparto de la nove sintezita Gas1-GFP ne estis grupigita kaj distribuita tra la ER-membrano, kiel observite per konvenciaj mikroskopoj (Figuro 4, A kaj B). Krome, granda procento de ERES (67%) inkluzivas du specojn de kargo kunlokigitaj en ĝi (Figuro 4D). Paneloj 1 kaj 2 de Figuro 4C montras du tipajn ekzemplojn de ERES kun interkovrantaj Gas1-GFP kaj Mid2-GFP. Krome, ambaŭ varoj estis rekrutitaj en la saman ERES (Figuro 4E, panelo 3 kaj filmo S4). Tial, niaj rezultoj indikas, ke la longo de la ceramida acilĉeno en la ER-membrano estas grava determinanto de ER-proteina agregado kaj klasifiko.
Sec31-1 GhLag1 ĉeloj esprimantaj galaktoz-induktitajn sekreciojn, Gas1-GFP (GPI-AP, verda) kaj Mid2-iRFP (TMP, blua) kaj konstituigan ERES-markitan Sec13-mCherry (ERES, magenta). Kovu je 37°C. Daŭrigu dum 30 minutoj, faligu la temperaturon ĝis 24°C por liberigi sekreciojn, kaj bildigu per SCLIM post 20 minutoj. (A ĝis C) Reprezentaj 2D projekciaj bildoj (A; skalbreto, 1μm) aŭ 3D ĉelhemisferaj bildoj (B kaj C; skala unuo, 0.45μm) de la 10 z-sekcioj markitaj per kargo kaj ERES. La malsupra panelo en (B) kaj la panelo en (C) montras prilaboritajn bildojn por montri nur la varojn ĉeestantajn en ERES (magenta) [Gas1-GFP (griza) kaj Mid2-iRFP (helblua)]. (C) Blanka plena sago: ERES, varoj interkovriĝas. Malferma sago: ERES enhavas nur unu eron. Malsupra panelo: La elektita ERES havas interkovrantajn varojn (1 kaj 2) markitajn per (C). Skalbreto, 100 nm. (D) Kvantigo de la mikrofoto priskribita en (C). En la unuoj sec31-1 kaj sec31-1 GhLag1, nur unu kargo (Gas1-GFP aŭ Mid2-iRFP) estas inkluzivita, kaj la meza procento de ERES por izolita kargo kaj interkovranta kargo. En tri sendependaj eksperimentoj, n = 432 en 54 ĉeloj (sec31-1) kaj n = 430 en 47 ĉeloj (sec31-1 GhLag1). Erarbreto = SD. Du-vosta nepara t-testo. *** P = 0,0002 (sec31-1) kaj ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D-bildo de elektita ERES kun interkovranta kargo (3) markita per (C). Gas1-GFP (verda) kaj Mid2-iRFP (blua) alproksimiĝas al ERES (magento) de la sama flanko kaj restas en la sama ERES-limigita areo. Skalbreto, 100 nm.
Ĉi tiu studo provizas rektan en vivajn pruvojn, ke lipid-bazitaj proteinaj kargoj estas klasifikitaj en selektemajn eksportajn lokojn en la sekrecia vojo, kaj malkaŝas la gravecon de acilĉenlongo por klasifika selektiveco. Uzante potencan kaj pintnivelan mikroskopian teknikon nomatan SCLIM, ni montris la nove sintezitan Gas1-GFP (grava plasmomembrana GPI-AP kun tre longa acilĉena (C26) ceramida lipida parto) en gisto. La regionoj grupigitaj en diskretaj ER-oj estas asociitaj kun specifaj ERES-oj, dum transmembranaj sekreciitaj proteinoj estas distribuitaj tra la ER-membrano (Figuro 1). Krome, ĉi tiuj du specoj de varoj eniras malsamajn ERES-ojn selekteme (Figuro 2). La acilĉenlongo de la ĉela ceramido en la membrano estas reduktita de C26 al C18-C16, la Gas1-GFP-areto estas interrompita en la diskretan ER-regionon, kaj Gas1-GFP estas redirektita por forlasi la ER kun la transmembrana proteino tra la sama ERES (Figuro 3 kaj Figuro 3).4).
Kvankam GPI-AP uzas specialigitan proteinan mekanismon por forlasi la ER, ni trovis, ke la C26-ceramid-dependa apartigo ne dependas de diferencigaj proteinaj interagoj, kiuj povus konduki al ERES-specialiĝo (Figuroj S4 kaj S5). Anstataŭe, niaj trovoj subtenas alternativan klasifikmekanismon, kiu estas pelita de lipid-bazita proteina agregaciado kaj posta ekskludo de aliaj kargoj. Niaj observoj indikas, ke al la Gas1-GFP-regiono aŭ areto asociita kun specifa ERES mankas la transmembrane sekreciita proteino Mid2-iRFP, kio indikas, ke la C26-ceramid-dependa GPI-AP-areto faciligos ilian eniron en la koncernan ERES, kaj samtempe ekskludos transmembranajn sekreciojn. La sekrecioj eniras ĉi tiun specifan ERES (Figuroj 1 kaj 2). Kontraste, la ĉeesto de C18-C16-ceramidoj en la ER-membrano ne kaŭzas, ke GPI-AP formas regionojn aŭ aretojn, do ili ne ekskludas aŭ anstataŭigas transmembrane sekreciitajn proteinojn en la saman ERES (Figuroj 3 kaj 4). Tial, ni proponas, ke C26-ceramido pelas apartigon kaj klasifikon faciligante la agregaciadon de proteinoj ligitaj al specifaj ERES.
Kiel atingi ĉi tiun C26-ceramid-dependan agregaciadon en specifan ER-areon? La tendenco de membrana ceramid disiĝi laterale povas kaŭzi, ke GPI-AP kaj C26-ceramid formas malgrandajn kaj tuj ordigitajn lipidojn en la pli neregula lipida medio de la ER-membrano, enhavanta pli mallongajn kaj nesaturitajn glicerolipidojn. Kvalitaj aretoj (17, 18). Ĉi tiuj malgrandaj provizoraj aretoj povas esti plue kunfanditaj en pli grandajn, pli stabilajn aretojn post ligado al la p24-komplekso (34). Konforme al tio, ni montris, ke C26 Gas1-GFP bezonas interagi kun la p24-komplekso por formi pli grandajn videblajn aretojn (Figuro 3). La p24-komplekso estas heterozygota oligomero konsistanta el kvar malsamaj p24-transmembranaj proteinoj en gisto (35), kiu provizas multvalentan ligadon, kiu povas konduki al krucligado de malgrandaj GPI-AP-aretoj, tiel generante pli grandan stabilan areton (34). La interago inter la proteinaj ektodomajnoj de GPI-AP-oj ankaŭ povas kontribui al ilia agregado, kiel montrite dum ilia Golgi-transporto en mamulaj polarigitaj epiteliaj ĉeloj (36). Tamen, kiam C18-C16 ceramido ĉeestas en la ER-membrano, kiam la p24-komplekso ligiĝas al Gas1-GFP, grandaj apartaj aretoj ne formiĝos. La subesta mekanismo povas dependi de la specifaj fizikaj kaj kemiaj ecoj de la longa acilĉena ceramido. Biofizikaj studoj de artefaritaj membranoj montras, ke kvankam kaj longaj (C24) kaj mallongaj (C18-C16) acilĉenaj ceramidoj povas kaŭzi fazapartigon, nur longaj acilĉenaj ceramidoj (C24) povas antaŭenigi altan kurbecon kaj filmfleksadon por transformi la filmon per reciproka referenco (17, 37, 38). Estis montrite, ke la transmembrana helico de TMED2, la homa homologo de Emp24, selekteme interagas kun C18-ceramid-bazita sfingomielino en la citoplasmaj lobuloj (39). Uzante molekuldinamikajn (MD) simulaĵojn, ni trovis, ke kaj C18 kaj C26-ceramidoj akumuliĝas ĉirkaŭ la citoplasmaj lobuloj de la Emp24-transmembrana helico, kaj ili havas similajn preferojn (Figuro S6). Indas rimarki, ke tio indikas, ke la transmembrana helico de Emp24 povas konduki al nesimetria distribuo de lipidoj en la membrano. Ĉi tio estas lastatempa rezulto bazita sur mamulaj ĉeloj. Similaj MD-simuladoj ankaŭ montras la ĉeeston de eteraj lipidoj (40). Tial, ni konjektas, ke C26-ceramido en la du lobuloj de ER26 estas loke riĉigita. Kiam GPI-AP en la lumenaj lobuloj rekte ligiĝas al multvalenta p24 kaj la amasiĝo de C26-ceramido ĉirkaŭ p24 en la citoplasmaj lobuloj, ĝi povas antaŭenigi la akompanantan proteinan agregadon kaj membranan kurbiĝon generitajn tra la fingroj (41), kaŭzante la disiĝon de GPI-AP en apartajn regionojn apud ERES, kio ankaŭ favoras la tre kurbajn regionojn de la ER-membrano (42). Antaŭaj raportoj subtenis la proponitan mekanismon (43, 44). La multvalenta ligado de oligolektinoj, patogenoj aŭ antikorpoj al ceramid-bazitaj glikosfingolipidoj (GSL) sur la plasmomembrano ekigas grandan GSL-agregadon, plifortigas fazapartigon kaj kaŭzas membranan deformadon kaj internigon (44). Iwabuchi ktp. (43) Oni trovis, ke ĉeestante longajn (C24) sed ne mallongajn (C16) acilĉenojn, la multvalenta ligando ligita al GSL-laktozilceramido induktis la formadon de grandaj aretoj kaj membranan invaginadon, kaj la citoplasmo Lyn-mediaciita signaltransdukto sur la folietoj estas interdigita per acilĉenoj en kunligitaj neutrofiloj.
En mamulaj polarigitaj epiteliaj ĉeloj, la koncentriĝo de la kontraŭ-Golgi-reto (TGN) ĝis la nivelo de la apeksa plasmomembrano kontrolas la apartigon kaj ordigon de GPI-AP (10, 45). Ĉi tiu agregado estas pelata de GPI-AP-oligomerigo (36), sed ĝi ankaŭ povas dependi de la longo de la ceramida ĉeno, kiun ni trovas en gisto. Kvankam mamula GPI-AP havas eter-lipid-bazitan ankron, kaj ĝia kemia strukturo estas tre malsama ol la tre longa acil-ĉena ceramido, lastatempa studo trovis, ke ambaŭ lipidoj havas evolucie similajn fizikajn kaj kemiajn ecojn kaj funkcion (40). Tial, la etera lipida parto en mamulaj ĉeloj povas esti simila al la C26-ceramido en gisto, kaj ĝia rolo estas asociiĝi kun la long-ĉena ceramido en la membrano por antaŭenigi GPI-AP-agregadon kaj ordigon. Kvankam ĉi tiu ebleco ankoraŭ bezonas esti rekte testita, antaŭaj trovoj subtenas, ke la transporto de la longa acil-ĉena ceramido al la Golgi-korpo ne estas farata per citoplasmaj transigaj proteinoj, sed dependas de la sintezo de GPI-ankroj kiel gisto. Tial, la evolua konservativa mekanismo ŝajnas kapabla selekteme kuntransporti tre longan acilĉenan ceramidon kaj GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) en la sama transportveziklo.
En gisto kaj mamulaj polarigitaj epiteliĉelsistemoj, GPI-AP-agrego kaj apartigo de aliaj plasmomembranaj proteinoj ĉiuj okazas antaŭ ol atingi la ĉelsurfacon. Paladino et al. (48) trovis, ke sur la TGN de ​​mamulaj polarigitaj epiteliĉeloj, GPI-AP-agregacio estas ne nur necesa por la selektema klasifiko de GPI-AP-oj al la apeksa plasmomembrano, sed ankaŭ reguligas la agregacian organizon de GPI-AP-oj kaj ĝian biologian agadon. Ĉelsurfaco. En gisto, ĉi tiu studo montris, ke la C26-ceramid-dependa GPI-AP-areto sur la ER povas reguligi la agregacian organizon kaj funkcian agadon de GPI-AP sur la plasmomembrano (24, 49). Konforme al ĉi tiu modelo, GhLag1-ĉeloj estas alergiaj al GPI-inhibiciiloj aŭ drogoj, kiuj influas la ĉelmuran integrecon (28), kaj la bezono de funkciaj Gas1-GFP-aretoj (49) de la pinta ceramido projekciita en la pariĝado de gistaj ĉeloj indikas Eblajn fiziologiajn konsekvencojn de hLag1-ĉeloj. GPI-AP-eraro. Tamen, plua testado ĉu la funkcia organizado de la ĉelsurfaco estis programita el la ER per ordigmetodo bazita sur lipida longo estos la temo de nia estonta esplorado.
La trostreĉoj de *Saccharomyces cerevisiae* uzitaj en ĉi tiu laboro estas listigitaj en Tabelo S1. La trostreĉoj MMY1583 kaj MMY1635 de SCLIM por bildigo de vivaj ĉeloj estis konstruitaj en la fono de W303. Ĉi tiuj trostreĉoj esprimantaj Sec13-mCherry kun fluoreska proteina etikedo estis konstruitaj uzante metodon bazitan sur polimeraza ĉenreakcio (PCR) kun plasmido pFA6a kiel ŝablono (23). La trostreĉo esprimanta Mid2-iRFP markitan per fluoreska proteino sub la kontrolo de la GAL1-reklamanto estis konstruita jene. PCR-amplifikado de iRFP-KanMx-sekvenco el vektoro pKTiRFP-KAN (donaco de E. O'Shea, plasmidnumero Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identigilo de esplorrimedo (RRID): Addgene_64687) kaj enigita en la C-finaĵon de endogena Mid2. Post kiam la Mid2-iRFP-genoma sekvenco estis amplifikita kaj klonita en la GAL1-reklamanton, ĝi estis integrita en la Not I-Sac I-ejon de la integriĝa plasmido pRS306. La rezulta plasmido pRGS7 estis linearigita kun Pst I por integriĝi en la URA3-lokuson.
La fuzia geno Gas1-GFP estas esprimita sub la kontrolo de la GAL1-promotoro en la centromera (CEN) plasmido, kiu estas konstruita jene. La Gas1-GFP-sekvenco estis amplifikita per PCR el la pRS416-GAS1-GFP-plasmido (24) (donaco de L. Popolo) kaj klonita en la Xma I–Xho I-lokon de la CEN-plasmido pBEVY-GL LEU2 (donaco de C). Miller; Addgene-plasmidnumero 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). La rezulta plasmido estis nomita pRGS6. La fuzia geno Axl2-GFP ankaŭ estas esprimita sub la kontrolo de la GAL1-promotoro de la vektoro pBEVY-GL LEU2, kaj ĝia konstruo estas jene. La Axl2-GFP-sekvenco estis amplifikita el la plasmido pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) per PCR, kaj klonita en la lokon Bam HI-Pst I de la vektoro pBEVY-GL LEU2. La rezulta plasmido estis nomita pRGS12. La sekvenco de la oligonukleotidoj uzitaj en ĉi tiu studo estas listigita en Tabelo S2.
La trostreĉiĝo estis kompletigita per 0.2% da adenino kaj 2% da glukozo [YP-dekstrozo (YPD)], 2% da rafinozo [YP-rafinozo] riĉa gista ekstrakta proteino p (YP) medio (1% gista ekstrakto kaj 2% proteino ept). (YPR)] aŭ 2% da galaktozo [YP-galaktozo (YPG)] kiel karbonfonto, aŭ en sinteza minimuma medio (0.15% gista nitrogena bazo kaj 0.5% amonia sulfato) por kompletigi taŭgajn aminoacidojn kaj bazojn necesajn por nutrado, kaj enhavanta 2% da glukozo (sinteza glukoza minimuma medio) aŭ 2% da galaktozo (sinteza galaktoza minimuma medio) kiel karbonfonto.
Por realtempa bildigo, temperatur-sentemaj sec31-1-mutaciaj ĉeloj esprimantaj la konstrukcion sub la GAL1-reklamanto estis kreskigitaj en YPR-medio je 24°C dumnokte ĝis mez-logaritma fazo. Post indukto en YPG je 24°C dum 1 horo, la ĉeloj estis inkubaciitaj en SG je 37°C dum 30 minutoj, kaj poste translokigitaj al 24°C por liberiĝi de la sekrecia bloko. Konkanavalino A estis uzata por fiksi la ĉelojn sur vitra glitplato kaj bildigitaj per SCLIM. SCLIM estas kombinaĵo de inversa fluoreska mikroskopo Olympus IX-71 kaj UPlanSApo 100×1.4 numera apertura olelenso (Olympus), altrapida kaj alt-signalo-bruo-rilatuma rotacianta diska konfokusa skanilo (Yokogawa Electric), speciala spektrometro, kaj speciala malvarmigo. La bilda intensigilo de la sistemo (Hamamatsu Photonics) povas provizi lupeolensan sistemon kun fina pligrandigo de ×266.7 kaj ŝarg-kuplita aparata fotilo, kiu multiplikas elektronojn (Hamamatsu Photonics) (21). Bildakiro estas farata per speciala programaro (Yokogawa Electric). Por 3D bildoj, ni uzis specialan piezoelektran aktuatoron por vibri la objektivan lenson vertikale, kaj kolektis la optikajn partojn 100 nm aparte en stako. La Z-staka bildo estas konvertita en 3D vokselajn datumojn, kaj la teoria punkta disvastiĝa funkcio uzata por la rotacianta diska konfokusa mikroskopo estas uzata por malkonvolucia prilaborado per Volocity-programaro (PerkinElmer). Per uzado de la programaro Volocity por aŭtomate sojlodigi por analizo de kunlokigo, oni mezuris ERES inkluzive de kargo. Analizo de linia skano estis farita per la programaro MetaMorph (Molecular Devices).
Uzu la programaron GraphPad Prism por determini statistikan signifon. Por la duflanka Studenta t-testo kaj la ordinara unudirekta variancanalizo (ANOVA), oni konsideras, ke diferencoj inter grupoj havas signifan efikon sur P <0,05 (*).
Por fluoreska mikroskopio de Gas1-GFP, la log-fazaj ĉeloj estis kreskigitaj dumnokte en YPD kaj kolektitaj per centrifugado, lavitaj dufoje per fosfato-bufrita salakvo, kaj inkubaciitaj sur glacio dum almenaŭ 15 minutoj, kaj poste proceditaj sub mikroskopo kiel antaŭe priskribite en Kontrolo (24). La Leica DMi8-mikroskopo (HCX PL APO 1003/1.40 oleo PH3 CS) ekipita per objektiva lenso, L5 (GFP) filtrilo, Hamamatsu-fotilo kaj Application Suite X (LAS X) programaro estis uzata por la akiro.
La specimenoj estis denaturigitaj per SDS-prova bufro je 65°C dum 10 minutoj, kaj poste apartigitaj per SDS-poliakrilamida ĝela elektroforezo (PAGE). Por imunoblota analizo, 10 μl da specimeno estis ŝarĝitaj por ĉiu leno. Primara antikorpo: Uzu kuniklan poliklonan kontraŭ-Gas1 je diluo de 1:3000, kuniklan poliklonan kontraŭ-Emp24 je diluo de 1:500, kaj kuniklan poliklonan kontraŭ-GFP (donaco de H. Riezman) je diluo de 1:3000. La musa monoklona kontraŭ-Pgk1 antikorpo estis uzita je diluo de 1:5000 (donaco de J. de la Cruz). Sekundara antikorpo: Krenperoksidazo (HRP) konjugita kapra kontraŭ-kunikla imunoglobulino G (IgG) uzita je diluo de 1:3000 (Pierce). HRP-konjugita kapra kontraŭmusa IgG estis uzata je diluo de 1:3000 (Pierce). La imunresponda zono estis observita per la kemilumineska metodo de SuperSignal West Pico-reakciilo (Thermo Fisher Scientific).
Kiel priskribite en (31), natura imunoprecipitada eksperimento estis farita sur la riĉigita ER-frakcio. Mallonge, lavu gistajn ĉelojn per TNE-bufro [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonila fluorido kaj proteaza inhibicia miksaĵo) je 600 nm (OD600) kun optika denseco de 100 dufoje. Ĝi estis rompita per vitroperloj, kaj poste la ĉelrestaĵoj kaj vitroperloj estis forigitaj per centrifugado. La supernatanto estis centrifugita je 17,000 g dum 15 minutoj je 4 °C. La precipitaĵo estis resuspendita en TNE kaj digitala saponino estis aldonita ĝis fina koncentriĝo de 1%. La suspendo estis inkubita dum 1 horo kun rotacio je 4 °C, kaj poste la nesolveblaj komponantoj estis forigitaj per centrifugado je 13,000 g je 4 °C dum 60 minutoj. Por Gas1-GFP imunoprecipitado, unue antaŭkovu la specimenon per malplenaj agarozaj globetoj (ChromoTek) je 4°C dum 1 horo, kaj poste kovu per GFP-Trap_A (ChromoTek) je 4°C dum 3 horoj. La imunoprecipititaj globetoj estis lavitaj kvin fojojn per TNE enhavanta 0.2% digoksigeninon, eluitaj per SDS-prova bufro, apartigitaj per SDS-PAGE, kaj analizitaj per imunoblotado.
Kiel priskribite en (31), la krucligado estis farita sur la riĉigita ER-frakcio. Mallonge, la riĉigita ER-frakcio estis inkubita kun 0.5 mM ditiobis(sukcinimidila propionato) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, Usono; 20°C, 20 min). La krucligado estis estingita per aldono de glicino (50 mM fina koncentriĝo, 5 minutoj, 20°C).
Kiel antaŭe priskribite (50), MS-analizo de ceramido en sovaĝtipaj kaj GhLag1-trostreĉoj estis farita. Mallonge, ĉeloj estis kreskigitaj ĝis eksponenta fazo (3 ĝis 4 OD600-unuoj/ml) en YPD je 30°C, kaj 25×107 ĉeloj estis rikoltitaj. Ilia metabolo estas estingita per trikloroacetata acido. Uzu ekstraktan solvilon [etanolo, akvo, etero, piridino kaj 4.2 N amonia hidroksido (15:15:5:1:0.018 v/v)] kaj 1.2 nmol da interna normo C17-ceramido (860517, Avanti polar lipid) kvalito. Uzu monometilaminan reakciilon [metanolo, akvo, n-butanolo kaj metilamina solvaĵo (4:3:1:5 v/v)] por plenumi mildan alkalan hidrolizon de la ekstrakto, kaj poste uzu akvo-saturitan n-butanolon por sensali. Fine, la ekstrakto estis resuspendita en pozitiva reĝima solvilo [kloroformo/metanolo/akvo (2:7:1) + 5 mM amonia acetato] kaj injektita en la masspektrometron. Plurreakcia monitorado (MRM) estis efektivigita por la identigo kaj kvantigo de sfingolipidaj molekuloj. La TSQ Vantage terciara kvadrupola masspektrometro (Thermo Fisher Scientific) estas ekipita per robota nanoflua jonfonto Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) por lipida analizo. La kolizia energio estas optimumigita por ĉiu ceramida kategorio. MS-datumoj estis akiritaj en pozitiva reĝimo. Por ĉiu biologia ripeto, la lipida signalo estas la mediano de tri sendependaj mezuradoj.
Kiel priskribite en (31), la ĉeloj (800×107) esprimantaj Gas1-GFP estis submetitaj al natura imunoprecipitado. La purigita Gas1-GFP estis apartigita per SDS-PAGE kaj transdonita al membrano de polivinilidenfluorido (PVDF). La proteino estis bildigita per tinkturado de PVDF per amida nigra. La Gas1-GFP-bendo estis fortranĉita de la PVDF kaj lavita 5 fojojn per metanolo kaj unufoje per akvo de grado likva kromatografio-MS (LC-MS). Per kovado de la membrana strio kun 500μl da 0.3 M NaOAc (pH 4.0), bufrosolvaĵo kaj 500μl da freŝe dissolvita 1 M natria nitrita miksaĵo je 37°C dum 3 horoj, la lipida frakcio estas liberigita de Gas1-GFP kaj lizita inter glukozamino kaj inozitolo (51). Post tio, la membrana strio estis lavita kvar fojojn per akvo de grado LC-MS, sekigita je ĉambra temperaturo, kaj konservita en nitrogena atmosfero je -80°C ĝis analizo. Kiel kontrolo, blanka specimeno de PVDF-membrano estis uzata por ĉiu eksperimento. La lipido ekstraktita el Gas1-GFP estis poste analizita per MS kiel priskribite (50). Mallonge, PVDF-strioj enhavantaj GPI-lipidon estis resuspenditaj en 75μl da negativa muldilsolvilo [kloroformo/metanolo (1:2) + 5 mM amonia acetato] kaj pasis elektroŝprucan jonigan (ESI)-MRM/MS-analizon de sfingolipidaj specioj (TSQ Vantage). En ĉi tiu kazo, MS-datumoj estis akiritaj en negativa jona reĝimo.
Kiel menciite antaŭe, la lipida parto de la GPI-ankro estis apartigita de la [3H]-inozitol-markita GPI-AP (16). La lipidoj estis apartigitaj per maldiktavola kromatografio uzante solventan sistemon (55:45:10 kloroformo-metanolo-0.25% KCl) kaj bildigitaj uzante FLA-7000 (Fujifilm).
La ĉeloj esprimantaj Gas1-GFP (600×107) estis lavitaj dufoje per TNE-bufro, kaj rompitaj per vitroperloj, kaj poste centrifugitaj por forigi ĉelajn restaĵojn kaj vitroperlojn. La supernatanto estis poste centrifugita je 17 000 g dum 1 horo je 4 °C. La precipitaĵo estis lavita en TNE kaj inkubita kun 1 U de PI-PLC (Invitrogen) en TNE enhavanta 0,2% da digitala saponino dum 1 horo je 37 °C. Post la enzima traktado, la membrano estis forigita per centrifugado je 17 000 g je 4 °C dum 1 horo. Por imunoprecipitigi Gas1-GFP, la supernatanto estis inkubita kun GFP-Trap_A (ChromoTek) je 4 °C dumnokte. La purigita Gas1-GFP apartigita per SDS-PAGE estis kolorita per Coomassie-brila bluo. La Gas1-GFP-kolora bendo estis fortranĉita de la griza ĉirkaŭaĵo ĉirkaŭ la akvedukto, kaj poste, post alkiligo per jodoacetamido kaj redukto per ditiotreitolo, en-ĝela digestado per tripsino estis farita. Ekstraktu kaj sekigu triptikajn peptidojn kaj peptidojn per GPI-glikanoj. La sekigita peptido estis dissolvita en 20 μl da akvo. Injektu parton (8 μl) en la LC-on. Oktadecilsilana (ODS) kolono (Develosil 300ODS-HG-5; interna diametro 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Aiĉi-prefektujo, Japanio) estis uzata por apartigi peptidojn sub specifaj gradientaj kondiĉoj. La movebla fazo estas solvilo A (0.08% formika acido) kaj solvilo B (0.15% formika acido en 80% acetonitrilo). Sistemo Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Bostono, Masaĉuseco) estis uzata por eluigi la kolonon per solvilo A ene de 55 minutoj je flukvanto de 50 μl min-1 dum 5 minutoj, kaj poste la koncentriĝo de solvilo B estis pliigita al 40%. , Usono). La eluaĵo estis kontinue enkondukita en la ESI-jonfonton, kaj la triptaj peptidoj kaj peptidoj kun GPI-glikanoj estis analizitaj per LTQ Orbitrap XL (hibrida lineara jonkaptilo-orbitrap-masspektrometro; Thermo Fisher Scientific). En la MS-aranĝo, la tensio de la kapilara fonto estis agordita je 4.5 kV, kaj la temperaturo de la transiga kapilaro estis konservita je 300 °C. La kapilara tensio kaj la tublensa tensio estis agorditaj je 15 V kaj 50 V, respektive. MS-datumoj estis akiritaj en la pozitiva jona reĝimo (rezolucio de 60 000; masprecizeco de 10 partoj po miliono) en masintervalo de 300/m/z maso/ŝarga proporcio (m/z) 3000. La MS/MS-datumoj estas akiritaj per la jonkaptilo en la LTQ Orbitrap XL [la unuaj 3 ciferoj de kiuj la datumoj dependas, kolizi-induktita disociiĝo (CID)].
MD-simuladoj estis faritaj per la programaro GROMACS (52) kaj la fortokampo MARTINI 2 (53-55). La CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) estis poste uzata por konstrui duoblan tavolon enhavantan dioleoilfosfatidilkolinon (DOPC) kaj Cer C18 aŭ DOPC kaj Cer C26. La topologio kaj koordinatoj de Cer C26 estas derivitaj de DXCE per forigo de la ekstraj globetoj de la sfingosina vosto. Uzu la procezon priskribitan sube por balanci la duoblan tavolon kaj funkciigi ĝin, poste uzu la lastajn koordinatojn de la sistemo por konstrui sistemon enhavantan Emp24. La transmembrana domajno de gisto Emp24 (restaĵoj 173 ĝis 193) estis konstruita kiel α-helico uzante la molekulan strukturon de la vida MD (VMD) ilo (58). Poste, post forigo de la interkovrantaj lipidoj, la proteino estis krude granulita kaj enigita en la duoblan tavolon uzante CHARMM GUI. La fina sistemo enhavas 1202 DOPC kaj 302 Cer C26 aŭ 1197 DOPC kaj 295 Cer C18 kaj Emp24. Jonigu la sistemon ĝis koncentriĝo de 0.150M. Kvar sendependaj ripetoj estis faritaj por du duoblaj tavoloj.
La duobla lipida tavolo estas ekvilibrigita per la CHARMM GUI-procezo, kiu implikas minimumigon kaj poste ekvilibrigon de 405 000 paŝoj, kie la poziciaj limigoj estas iom post iom reduktitaj kaj eliminitaj, kaj la tempopaŝo estas pliigita de 0,005 ps ĝis 0,02 ps. Post ekvilibrigo, ĝi produktas 6 µs kun tempopaŝo de 0,02 ps. Post enmeto de Emp24, uzu la saman CHARMM GUI-procezon por minimumigi kaj ekvilibrigi la sistemon, kaj poste funkciu dum 8 sekundoj en produktado.
Por ĉiuj sistemoj, dum la ekvilibriga procezo, la premo estas kontrolata per la Berendsen-barostato (59), kaj dum la produktada procezo, la premo estas kontrolata per la Parrinello-Rahman-barostato (60). En ĉiuj kazoj, la averaĝa premo estas 1 baro kaj duonizotropa premkupla skemo estas uzata. En la ekvilibra kaj produktada procezo, termostato (61) kun rapida rekalibrado estas uzata por kunligi la temperaturon de proteino, lipido kaj solventaj partikloj respektive. Dum la tuta operacio, la cela temperaturo estas 310K. La ne-liga interagado estas kalkulita per generado de pariglisto uzante la Verlet-skemon kun 0.005-bufra toleremo. La Kulomba termo estas kalkulita uzante la reakcian kampon kaj limdistancon de 1.1 nm. La Vander Waals-termo uzas limskemon kun limdistanco de 1.1 nm, kaj la Verlet-limskemo estas uzata por ebla drivo (62).
Uzante VMD, la limdatolongo inter DOPC-fosfataj globetoj aŭ ceramidaj AM1 globetoj kaj la proteino estas 0.7 nm, kaj la nombro da lipidoj, kiuj interagas kun la proteino, estas kalkulita. Laŭ la sekva formulo, kalkulu la malplenig-riĉigan (DE) faktoron kiel en (63): DE-faktoro = (la kvanto de totalaj lipidoj en la proteino 0.7) en la proteino 0.7 (la kvanto de Cer en totalaj lipidoj)
La raportita valoro estas akirita kiel averaĝo, kaj la erarstangoj estas kvar sendependaj kopioj de SE. La statistika signifo de DE-faktoro estas kalkulita per t-testo [(averaĝoDE-faktoro-1)/SE]. Kalkulu la P-valoron el la unu-vosta distribuo.
La ilo GROMACS estis uzata por kalkuli la 2D lateralan densecmapon de la sistemo enhavanta Emp24 ene de la lastaj 250 ns de la spuro. Por akiri la riĉigan/malplenigan mapon de ceramido, la densecmapo de Cer estas dividita per la sumo de la mapo de Cer kaj DOPC, kaj poste dividita per la koncentriĝo de Cer en la korpo. La sama kolormapskalo estas uzata.
Por suplementaj materialoj por ĉi tiu artikolo, bonvolu vidi http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Ĉi tiu estas artikolo kun libera aliro, distribuita laŭ la kondiĉoj de la permesilo Krea Komunaĵo Atribuite-Nekomerce, kiu permesas la uzon, distribuon kaj reproduktadon en iu ajn medio, kondiĉe ke la fina uzo ne estas por komerca profito kaj la premiso estas, ke la originala verko estas ĝusta. Referenco.
Noto: Ni nur petas vin provizi vian retpoŝtadreson por ke la persono, kiun vi rekomendas al la paĝo, sciu, ke vi volas, ke ili vidu la retpoŝton kaj ke ĝi ne estas spamo. Ni ne kaptos iujn ajn retpoŝtadresojn.
Ĉi tiu demando estas uzata por testi ĉu vi estas vizitanto kaj malhelpi aŭtomatan spam-sendon.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Ar Miho Waga (Miako Lopez), Ar Miho Waga Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D alt-rezolucia realtempa bildigo rivelas la gravecon de ceramida ĉenlongo por proteina ordigo en selektemaj produktejoj.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Ar Miho Waga (Miako Lopez), Ar Miho Waga Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D alt-rezolucia realtempa bildigo rivelas la gravecon de ceramida ĉenlongo por proteina ordigo en selektemaj produktejoj.
©2020 Amerika Asocio por la Akcelo de Scienco. ĉiuj rajtoj rezervitaj. AAAS estas partnero de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef kaj COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.