Dankon pro via vizito al Nature.com. La retumilversio, kiun vi uzas, havas limigitan subtenon por CSS. Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu kongruecan reĝimon en Internet Explorer). Dume, por certigi daŭran subtenon, ni montros la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Male al vertebruloj, oni ĝenerale supozas, ke insektoj ne havas vir-antaŭjuĝajn seksajn steroidajn hormonojn. Ĉe *Anopheles gambiae*, la ekdizona steroido 20-hidroksiekdizono (20E) ŝajnas esti evoluinta por kontroli ovodisvolviĝon kiam sintezita de inoj2 kaj por indukti pariĝan obstinan periodon kiam sekse transdonita de maskloj3. Ĉar ovodisvolviĝo kaj pariĝado estas esencaj reproduktaj trajtoj, kompreni kiel inaj anofeloj integras ĉi tiujn hormonajn signalojn povus faciligi la dezajnon de novaj malariokontrolaj programoj. Ĉi tie, ni malkaŝas, ke ĉi tiuj reproduktaj funkcioj estas reguligitaj de apartaj seksaj steroidoj tra kompleksa reto de ekdisteroid-aktivigaj/malaktivigaj enzimoj. Ni identigis vir-specifan oksidigitan ekdizonon, 3-dehidro-20E (3D20E), kiu protektas gepatrecon per fermado de ina seksa akceptemo post seksa translokigo kaj aktivigo per defosforiligo. Rimarkinde, 3D20E-translokigo ankaŭ induktis la esprimon de reproduktaj genoj, kiuj subtenas ovodisvolviĝon dum Plasmodium-infekto, certigante la sanon de infektitaj inoj. In-derivita 20E ne elvokas seksan... respondo, sed permesas al pariĝaj individuoj demeti ovojn post kiam 20E-inhibiciantaj kinazoj estas inhibiciitaj. La identigo de ĉi tiu vir-specifa insekta steroida hormono kaj ĝia rolo en reguligo de ina seksa akcepteco, fekundeco kaj interagado kun Plasmodium sugestas la potencialon redukti la reproduktan sukceson de malario-transdonantaj moskitoj.
Malariokazoj kaj mortoj denove pliiĝas4 pro ĝeneraligita insekticida rezisto ĉe anofeloj, la sola vektoro de homaj malarioparazitoj. La pariĝa biologio de ĉi tiuj moskitoj estas precipe alloga celo por novaj malariokontrolaj intervenoj, ĉar inoj pariĝas nur unufoje5; steriligi ĉi tiun unuopan pariĝan eventon havus grandan potencialon redukti moskitpopulaciojn sur la kampo.
Virinoj fariĝas sekse senkapabligitaj post ricevado de alt-titra steroidaj hormonoj de viroj. Studoj montris, ke la ellasilo por malfacilaĵo en plia pariĝo estas 20-hidroksiekdizono (20E), steroida hormono pli bone konata kiel regulilo de la plumŝanĝa ciklo en la larva stadio. La kapablo de maskloj sintezi kaj transdoni 20E evoluis specife en Anopheles specioj, kiuj estas parto de la subgenro Cellia7, kiu estas distribuita en Afriko kaj inkluzivas la plej danĝerajn vektorojn de malario, inkluzive de Anopheles gambiae. Ĉi tio estas aparte rimarkinda ĉar ĉe ĉi tiuj specioj inoj ankaŭ produktas 20E post ĉiu sangomanĝo, kaj 20E pelas la oogenezan ciklon (vidu ref. 8). Tamen, malmulte oni scias pri la maniero, kiel inoj integras signalojn de du malsamaj fontoj de ekdizono (maskla translokigo kaj sangomanĝiga indukto) sen kompromiti sian propran kapablon pariĝi. Fakte, se la 20E produktita de la inoj ekigas seksan maltoleremon, tio kondukos al malfekundeco ĉe virgule nutriĝantaj individuoj, tre ofta konduto ĉe ĉi tiuj moskitoj5.
Ebla klarigo estas, ke maskloj de *A. gambiae* transdonas modifitan vir-specifan ekdizonon, kiu aktivigas signalan kaskadon en la ina genera vojo, rezultante en pariĝa malstabileco. Tamen, kvankam vertebruloj havas plurajn steroidajn hormonojn, kiel ekzemple estrogenon kaj androgenon (reviziitajn en ref. 9), laŭ nia scio, androgen-partiaj steroidoj ne estis identigitaj en insektoj.
Ni celis determini la repertuaron de steroidaj hormonoj en la vira akcesora glando (MAG) de sekse matura A. gambiae serĉante eblajn modifantajn steroidojn. Uzante alt-efikecan likvan kromatografion kunligitan kun tandema mas-spektrometrio (HPLC-MS/MS) anstataŭ la malpli specifa metodo antaŭe uzita, ni detektis ekdizonon (E) kaj 20E en ĉi tiu histo, konfirmante antaŭan rezulton. Tamen, la specimeno estis dominita de oksidigitaj fosforilitaj steroidoj, konforme al la formulo 3-dehidro-20E-22-fosfato (3D20E22P)12 (Figuro 1). Aliaj formoj inkluzivas 3-dehidro-20E (3D20E) kaj 20E-22-fosfaton (20E22P). La HPLC-MS/MS-signalintenseco de 3D20E22P estis du grandordojn pli alta ol ĝia defosforilita formo, 3D20E, kaj tri grandordojn pli alta ol tiu de E kaj 20E (Figuro 1). Kvankam en aliaj partoj de la korpo kaj la malsupra... genera vojo (LRT; Plilongigitaj Datumoj Fig. 1a). Ni ankaŭ analizis ekdisteroidojn en ĵus fermitaj (<1 tagaj) maskloj kaj inoj kaj detektis 3D20E kaj 3D20E22P nur en MAG; E, 20E kaj 20E22P ĉeestis en ambaŭ seksoj (Plilongigitaj Datumoj Fig. 1b). Ĉi tiuj datumoj sugestas, ke plenkreskaj maskloj de A. gambiae produktas altajn nivelojn de modifaj hormonoj en siaj MAG-oj, kiujn inoj ne sintezas.
MAG kaj ina LRT (inkluzive de atrioj, spermvezikoj kaj parovario) estis dissekcitaj el 4-tagaj (4-tagaj) virgaj maskloj kaj virgaj kaj pariĝintaj inoj (0,5, 3 kaj 12 hpm). Ecdysone en ĉi tiuj histoj estis analizita per HPLC-MS/MS (meznombro ± sem; nepara t-testo, duflanka, korektita per la indico de falsa malkovro (FDR); NS, ne signifa; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 horoj kontraŭ 0,5 horoj, P = 0,035; 12 horoj kontraŭ 3 horoj, P = 0,0015; 12 horoj kontraŭ 0,5 horoj, P = 0,030. 3D20E22P: 3 horoj kontraŭ 0,5 horoj, P = 0,25; 12 horoj kontraŭ 3 horoj, P = 0,0032; 12 horoj kontraŭ 0,5 horoj, P = 0,015). Datumoj estas el tri biologiaj ripetoj. La pinta areo por ĉiu interesata ekdizono estis kalkulita kaj normigita per la nombro da moskitoj. Ekdizono estas reprezentita per koloro jene: E, verda; 20E, oranĝa; 20E22P, viola; 3D20E, blua; 3D20E22P, rozkolora. La enmetitaĵo pliigas la skalon sur la y-akso por montri pli malaltajn ekdizonajn nivelojn.
Por esplori ĉu 3D20E22P kaj 3D20E estas transdonitaj dum pariĝado, ni dissekcis inajn LRT-ojn je diversaj tempoj post pariĝado. Kvankam ekdizono ne estis trovita en virgulinoj, ni observis grandajn kvantojn de 3D20E22P en la LRT tuj post pariĝado (0.5 h post pariĝado, hpm), malpliiĝante laŭlonge de la tempo, dum la niveloj de 3D20E signife pliiĝis (Fig. 1). Uzante kemie sintezitan 3D20E kiel normon, ni determinis, ke la niveloj de ĉi tiu steroida hormono en pariĝaj LRT-oj estis almenaŭ 100-oble pli altaj ol 20E (Etendita Datuma Tabelo 1). Tiel, 3D20E22P estas la ĉefa maskla ekdizono, kiu estas transdonita al la ina LRT dum pariĝado, kaj ĝia defosforiligita formo, 3D20E, fariĝas tre abunda baldaŭ post pariĝado. Ĉi tio sugestas gravan rolon por ĉi-lasta ekdizono en ina post-pariĝa biologio.
Post generado de nova RNA-sekvencada (RNA-sekvencado) datumbazo (Fig. 2a), uzante speciale konstruitan bioinformadikan dukton, ni serĉis ekdizonan kinazon (EcK), ekdizonan oksidazon (EO), kaj ekdizonon kodantan 20E-modifitan fosfatazan genon. EPP) estas esprimita en generaj histoj. Ni identigis unu kandidat-EPP-genon kaj du eblajn EcK-genojn (EcK1 kaj EcK2), sed ne povis trovi bonan kandidat-EO-genon. Rimarkinde, individuaj EPP-genoj estis esprimitaj je altaj niveloj (98,9-a percentilo) en gambiaj MAG-oj sed ne en inaj LRT-oj (Fig. 2b), kontraŭe al niaj atendoj ĉar defosforiligo de 3D20E22P okazis en ĉi tiu ina histo. Tial, ni kredas, ke maskla EPP povas esti transdonita dum pariĝado. Efektive, ni uzis en vivan stabilan izotopan markadon por maski la inan proteinon post pariĝado, enzimo identigita per MS en la ina atrio (Fig. 2c kaj Aldona Tabelo 1). La ĉeesto de EPP en MAG kaj parigita (sed ne virga) ina LRT ankaŭ estis konfirmita uzante specifajn antikorpojn (Fig. 2d).
a, Speciale konstruita bioinformatika dukto por serĉi la generajn histojn de ĉiu sekso por genoj kodantaj EcK-ojn, EO-ojn kaj EPP-ojn. La nombroj apud la sagoj indikas la nombron de viraj kaj inaj kandidatoj ĉe ĉiu paŝo. Ĉi tiu analizo identigis unu EPP-genon (EPP) kaj unu EcK-genon (EcK1) kiuj estas esprimitaj en maskloj, kaj unu EcK-genon (EcK2) kiu estas esprimita en ambaŭ seksoj sed ne donas kandidatan EO-genon. b, Varmomapo komparanta kandidatan genesprimon en virgaj (V) kaj pariĝaj (M) histoj de Anopheles gambiae kaj Anopheles albicans. Spca, fekundigo; MAG-oj, akcesoraj glandoj en maskloj; aliaj korpopartoj, inkluzive de mamoj, flugiloj, kruroj, grasaj korpoj kaj internaj organoj en ambaŭ seksoj, kaj ovarioj en inoj. EcK2 estas tre esprimita en kaj MAG kaj atrioj de Gambio, dum EPP troviĝas nur en MAG. c, Proteomika analizo de translokigo de maskla ejakula grupo en inajn atriojn je 3, 12 kaj 24 ĉevalpovoj minute, montrante la 67 plej abundajn proteinojn. Inoj estis kreskigitaj per dieto enhavanta 15N por etikedi (kaj maski) ĉiujn proteinojn. Neetikeditaj maskloj estis parigitaj kun etikeditaj inoj, kaj inaj LRT-oj estis dissekcitaj je 3, 12 kaj 24 ĉevalpovoj minute por proteomika analizo (vidu Suplementan Tabelon 1 por kompleta listo de ejakulaj proteinoj). Enmetita bildo, EPP, Eck1 kaj EcK2 estis detektitaj en la MAG de virgaj maskloj per proteomika analizo de ĉi tiuj histoj. d, EPP estis detektita per okcidenta makuleco en MAG kaj LRT de parigitaj inoj, sed ne en virgaj inoj aŭ maskloj aŭ la resto de la ino. korpo. Membranoj estis samtempe prisonditaj per kontraŭ-aktino (ŝarĝkontrolo) kaj kontraŭ-EPP antikorpoj. Ĉiuj maskloj estas virgulinoj. Vidu Suplementan Figuron 1 por datumoj pri la ĝelfonto. Okcidentaj makuloj estis faritaj dufoje kun similaj rezultoj.
La ekdisteroida fosfofosfataza aktiveco de EPP estis kontrolita post inkubacio per HPLC-MS/MS kun 3D20E22P izolita de MAG (Etenditaj Datumoj Fig. 2a). Krome, kiam ni silentigis EPP per RNA-mediaciita interfero (RNAi), ni detektis fortan redukton de fosfataza aktiveco en la generaj histoj de ĉi tiuj maskloj (Fig. 3a), kaj inoj pariĝintaj kun EPP-silentigitaj maskloj montris signifan pli malaltan proporcion de defosforiligita 3D20E (Fig. 3b) malgraŭ parta gena silentigo (Etenditaj Datumoj Fig. 2b,c). Kontraste, ni ne detektis signifajn ŝanĝojn en la 20E22P/20E-proporcio en la samaj moskitoj, kio eble sugestas, ke la enzimo estas specifa por 3D20E22P (Fig. 3b).
a, Malkreskinta fosfataza aktiveco en MAG kaŭzita de EPP-silentigo uzante duoble-fadenajn EPP RNA (dsEPP) aŭ duoble-fadenajn GFP RNA (dsGFP) kontrolojn. Dudek MAG-aroj estis uzitaj en ĉiu ripeto (P = 0,0046, parigita t-testo, duflanka), reprezentitaj per apartaj punktoj. b, Inoj parigitaj kun EPP-silentigitaj maskloj havis signife pli malaltan proporcion de defosforiligita 3D20E je 3 hpm (P = 0,0043, neparigita t-testo, duflanka), dum 20E-niveloj estis netuŝitaj (P = 0,063, neparigita). t-testo, duflanka). Datumoj estas prezentitaj kiel meznombro ± sem de tri grupoj de po 13, 16 kaj 19 inoj.c, Inoj pariĝis kun EPP-silentigitaj maskloj havis signife pli altajn repariĝo-oftecojn (P = 0,0002, la preciza testo de Fisher, duflanka). Inoj unue estis devigitaj pariĝi por certigi sian pariĝan statuson; Du tagojn poste, ili estis kontaktitaj kun aliaj maskloj portantaj transgenan spermon por taksi re-seksajn indicojn per kvanta PCR-detekto de la transgeno.d, Sango-nutritaj inoj pariĝintaj kun EPP-silentigitaj maskloj havis signife reduktitan fekundecon (P < 0,0001; Mann-Whitney-testo, duflanka) kaj iomete reduktitan ovnombron (P = 0,088, Mann-Whitney-testo, duflanka), dum la ovumado ne estis trafita (P = 0,94, la preciza testo de Fisher, duflanka). En ĉiuj paneloj, n reprezentas la nombron de biologie sendependaj moskitprovaĵoj. NS, ne signifa. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Poste, ni taksis ĉu ekdizona defosforiligo gravas por indukti pariĝan reziston ĉe inoj. Rimarkinde, inoj pariĝis kun EPP-malplenigitaj maskloj repariĝis je multe pli alta ofteco (44.9%) ol kontrol-inoj (10.4%) kiam eksponitaj al pliaj (transgenaj) maskloj (Fig. 3c). Ni ankaŭ observis signifan malpliiĝon de fekundeco (Fig. 3d, maldekstre) kaj iometan malpliiĝon de la nombro da ovoj demetitaj de ĉi tiuj inoj (Fig. 3d, meze), dum la procento de ovoj demetitaj de inoj (alia respondo elvokita ĉe inoj per pariĝado) ne estis trafita (Fig. 3d, dekstre). Konsiderante la observitan specifecon de EPP por 3D20E22P, ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke la aktivigo de 3D20E per EPP transdonita dum pariĝado povus havi gravan rolon en malŝaltado de ina akceptemo al plia pariĝado, konduto antaŭe atribuita al la seksa transdono de 20E. Tial, ĉi tiu vir-specifa hormono ankaŭ forte influas inan fekundecon.
Poste, ni komparis la aktivecojn de 20E kaj 3D20E en injektaj eksperimentoj ĉe sekse maturaj virgulinoj uzante kemie sintezitan 3D20E (Fig. 4a-c) kaj komerce haveblan 20E. Ni observis, ke 3D20E estis signife pli efika ol 20E por ĉesigi inan sentemon al pariĝado ĉe ambaŭ koncentriĝoj (Fig. 4d). Rimarkinde, duono de la fiziologia nivelo de 3D20E en la LRT (1,066 pg post-injekto kontraŭ 2,022 pg post-pariĝado) induktis proporcion de obstinaj inoj, kiu estis 20-oble pli alta ol la fiziologia nivelo de 20E (361 pg post-injekto) 24 horojn post injekto ĉe la plej alta koncentriĝo 18 pg post-pariĝado; Plilongigita Datuma Tabelo 1). Ĉi tiu rezulto kongruas kun la ideo, ke seksa transdono de 20E ne kaŭzas pariĝajn obstinajn periodojn, kaj plue indikas 3D20E kiel gravan faktoron por certigi la gepatro-infanan rilaton. 3D20E ankaŭ estis signife pli aktiva ol 20E en ovdemetado-testoj ĉe virgaj inoj (Fig. 4e), sugestante, ke la normala ovdemetado-ofteco, kiun ni observis post parta EPP-silentigo, ŝuldiĝis al la ĉeesto de resta 3D20E-aktiveco ankoraŭ produktita de Pariĝi-induktitaj inaj faktoroj.
(a,b) 3D20E kemie sintezita el 20E (a) kun tre alta konvertiĝo/efikeco (datumoj prezentitaj kiel meznombro ± sem de tri sendependaj sintezaj reakcioj) (b).c, Masa spektro (malsupra duono) precize kongruas kun ekdizono trovita en pariĝinta ina LRT (supra duono).d, Kompare kun 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; preciza testo de Fisher, duflanka) kaj 10% etanolo (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; preciza testo de Fisher, duflanka), dum 20E estis signife pli alta ol kontrolo nur ĉe pli altaj dozoj (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; preciza testo de Fisher, duflanka).e, 3D20E injekto induktis signife pli altajn ovumado-rapidecojn en virgaj inoj ol 10%-etanolaj kontroloj (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; preciza testo de Fisher, duflanka), dum 20E komparis kun kontroloj nur ĉe pli altaj dozoj (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; preciza testo de Fisher, duflanka). 3D20E induktis signife pli altajn ovumado-rapidecojn ol 20E ĉe pli altaj dozoj (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; preciza testo de Fisher, duflanka). En ĉiuj paneloj, n reprezentas la nombron de biologie sendependaj moskitspecimenoj. NS, ne signifa. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Datumoj estas el tri ripetoj.
En antaŭaj studoj, ni determinis, ke seksa translokigo de steroidaj hormonoj induktas la esprimon de MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), ina reprodukta geno, kiu protektas inojn de A. gambiae kontraŭ infekto de P. falciparum. Sankostoj kaŭzitaj de 13, la plej mortiga homa malaria parazito. Konsiderante la gravecon de MISO por la reprodukta taŭgeco de Anopheles en malario-endemiaj areoj, ni decidis determini, kiu hormono 3D20E aŭ 20E ekigas la esprimon de ĉi tiu geno. Ni trovis, ke dum 20E-injekto specife aŭ pli potence induktas iujn nukleajn hormonajn receptorojn (HR), kiel ekzemple HR3 kaj HR4, kaj tipajn subfluajn steroidajn celojn, kiel ekzemple la yolkogenajn genojn Vg14, 15, 16, MISO estis pli forte induktita de 3D20E (Etenditaj Datumoj Fig. 3). Tiel, la seksa translokigo de ĉi tiu androgena steroida hormono ŝajnas indukti mekanismojn, kiuj protektas inojn kontraŭ la kostoj kaŭzitaj de parazita infekto. Plue, 3D20E malsame influas ambaŭ... izoformoj de la E-receptoro EcR, induktantaj EcR-A kaj subpremantaj EcR-B, kaj pli forte ekigantaj aliajn pariĝ-induktantajn genojn, inkluzive de HPX15, kiu influas inan fekundecon. Ĉi tio povus klarigi la signifan malfekundecon observitan ĉe inoj pariĝintaj kun EPP-silentigitaj maskloj (Etenditaj Datumoj Fig. 3). Ĉi tiuj datumoj sugestas la ekziston de malsuprenfluaj vojoj preferate aktivigitaj de du ekdisonaj hormonoj, kiuj povus subesti seksspecifan funkcion.
Poste, ni testis la funkcion de la du EcK-genoj identigitaj en nia bioinformadika procezo. Silentigo de EcK1 aŭ EcK2 rezultigis signifan mortecon ĉe maskloj (Etenditaj Datumoj Fig. 4a), sugestante ke ecdizona fosforiligo, kaj tial malaktivigo, estas grava por supervivo. Ĉar EcK2 estis esprimita je pli altaj niveloj ol EcK1 kaj estis detektita en MAG-oj per proteomiko (Fig. 2b,c kaj Aldona Tabelo 2), ni validigis ĝian ecdisteroidan kinazan aktivecon per inkubado kun 20E, kio rezultigis fosforiligon de 20E22P (Etenditaj Datumoj Fig. 2).4b). Uzante 3D20E kiel substraton, ni ne povis detekti la fosforiligitan produkton 3D20E22P (Etenditaj Datumoj Fig. 4c), sugestante ke 20E anstataŭ 3D20E povus esti la preferata celo de EcK2.
Laŭ nia RNA-sekvenca analizo, EcK2 ankaŭ estis tre esprimita en la LRT de virgaj inoj, kie ĝi estis malŝaltita post pariĝado (Fig. 2b). Ni konfirmis ĉi tiujn datumojn kaj determinis, ke la esprimo de EcK2 ne estis influita de sangomanĝado (Etenditaj Datumoj Fig. 5a). Etendante niajn komencajn MS-eksperimentojn, ni determinis, ke la pinto de 20E22P estis proksime rilata al la pinto de 20E (22-26 horojn post sangomanĝo; Etenditaj Datumoj Fig. 5b). Silentigo de EcK2 en virgaj inoj rezultigis 3-oblan pliiĝon en la relativa proporcio de 20E al 20E22P je 26 horoj post sangomanĝo (Etenditaj Datumoj Figuroj 2c kaj 5c), konfirmante, ke EcK2 ankaŭ fosforiligas 20E en inoj. Rimarkinde, EcK2-malplenigitaj virgulinoj konservis plenan seksan akceptemon (Etenditaj Datumoj Fig. 5d,e), plue sugestante, ke ina produktado de 20E ne induktas pariĝajn obstinajn periodojn. Tamen, ĉi tiuj inoj havis signife pliigitaj ovdemetado-oftecoj kompare kun kontroloj, kun pli ol 30% de virgulinoj demetantaj ovojn (Etenditaj Datumoj Fig. 5f). Se duoble-fadenaj Eck2 RNA (dsEcK2) injektoj estis faritaj post sangomanĝo, ovumado ne okazis, kaj tiam la 20E-pinto pro sangokonsumo malpliiĝis. Ĝenerale, ĉi tiuj rezultoj subtenas modelon, ke 20E produktita post sangosuĉo povas indukti ovumadon, sed nur kiam la ovumada blokado (EcK2 kaj eble aliaj faktoroj) estas malŝaltita per pariĝado. Nek 20E nek 3D20E-injektoj inhibiciis EcK2-esprimon en virgulinoj (Etenditaj Datumoj Fig. 5g), sugestante, ke aliaj faktoroj mediacias la inhibicion de ĉi tiu kinazo. Tamen, 20E-niveloj post sangomanĝo ne sufiĉis por indukti pariĝan malkomforton, sed estis efike ekigitaj per altaj titoloj de sekse transdonita 3D20E.
Niaj rezultoj provizas gravajn komprenojn pri la mekanismoj reguligantaj la reproduktan sukceson de A. gambiae. Modelo aperis, kie maskloj evoluis por sintezi altajn titrojn de 3D20E, vir-specifa modifita ecdizono, kiu certigas gepatrecon per malsentemigo de inoj al plia pariĝo. Samtempe, ĉi tiuj malario-vektoroj ankaŭ evoluigis efikan sistemon por aktivigi 3D20E en inoj responde al la seksa transdono de vir-specifa EPP. Laŭ nia scio, ĉi tiu estas la unua ekzemplo de vir- kaj virin-dominita steroida hormona sistemo plenumanta unikan kaj kritikan funkcion en insektoj. Vir-specifa ecdizona funkcio estis postulita sed ne definitive montrita. Ekzemple, plejparte refutita hipotezo 18 estas, ke ĉi tiuj funkcioj povas esti plenumitaj de la 20E antaŭulo E1. Estas bone konate, ke en Bananmuŝo, monandrio estas ekigita per la seksa transdono de malgrandaj seksaj peptidoj 19,20, kiuj interagas kun neŭronoj nervizantaj la inan reproduktan vojon per specifaj seksaj peptidaj receptoroj 21,22. Plia laboro estas necesa por determini la laŭfluajn signalajn kaskadojn. kontrolite de 3D20E en A. gambiae inoj kaj por determini ĉu ĉi tiuj kaskadoj povas esti konservitaj inter moskitoj kaj Bananmuŝo.
Konsiderante la gravan rolon de 3D20E sur ina fekundeco kaj konduto identigita en nia studo, la vojoj kondukantaj al 3D20E-sintezo kaj aktivigo ofertas novajn ŝancojn por estontaj moskito-kontrolaj strategioj, kiel ekzemple la generado de konkurencivaj sterilaj maskloj en sterilaj insektaj teknologiaj strategioj. Uzu por sovaĝa liberigo aŭ por imiti la 3D20E en virga ludo. La vir-specifa funkcio de 3D20E eble evoluis kiam A. gambiae kaj aliaj Cellia specioj akiris la kapablon koaguli sian spermon en pariĝajn ŝtopilojn, ĉar tio permesas la efikan translokigon de granda nombro da hormonoj kaj hormon-aktivigaj enzimoj. Siavice, 3D20E-evoluo efektiviganta monandrion provizas mekanismon por inoj (per alta esprimo de MISO) por favori sian reproduktan taŭgecon en areoj kun alta malaria tropezo, kiu nerekte kontribuas al Plasmodium-transdono. Ĉar ina 20E montriĝis havi profundajn efikojn sur la supervivo kaj kresko de P. falciparum en inaj Anopheles-moskitoj,24 kaj viraj kaj inaj steroidaj hormonaj vojoj nun estas ŝlosilaj aspektoj de moskito-parazitaj interagoj.
A. gambiae G3-trostreĉoj estis breditaj sub normaj insektaj kondiĉoj (26-28 °C, 65-80% relativa humideco, 12:12 h lumo/malluma fotoperiodo). Larvoj estis nutritaj per pulvora fiŝmanĝaĵo (TetraMin Tropikaj Flokoj, Koiaj Buletoj kaj Tetra Lagetaj Bastonetoj en proporcio de 7:7:2). Plenkreskaj moskitoj estis nutritaj laŭvole per 10% dekstroza solvaĵo kaj ĉiusemajne homa sango (studu sangokomponantojn). Virgaj moskitoj estis akiritaj per apartigo de la seksoj ĉe la pupa stadio post ekzameno de la finoj per mikroskopio. Maskloj portantaj la DsRed-transgenon estis priskribitaj antaŭe.
Devigitaj pariĝaj eksperimentoj estis faritaj laŭ antaŭe priskribitaj protokoloj. Por natura pariĝado, 4-tagaj virgaj inoj estis tenataj en proporcio de 1:3 kun sekse maturaj virgaj maskloj dum du noktoj. Por eksperimentoj en kiuj maskloj estis injektitaj per dsEPP, kun-kaĝado koincidis kun tagoj 3-4 post la injekto, kiam fosfataza aktiveco estis maksimume silentigita (Etenditaj Datumoj Fig. 2b).
Moskit-histoj, restantaj kadavroj (cetero de la korpo), aŭ tuta korpo estis dissekcitaj en 100% metanolon kaj homogenigitaj per blendero (2 mm vitroperloj, 2.400 rpm, 90 sekundoj). La kvantoj de histo kaj volumoj de metanolo estis jenaj: cetero de la korpo, 50 en 1.000 µl; MAG, 50–100 × 80 µl; ina LRT, 25–50 × 80 µl. La precipitaĵo estis submetita al dua metanola ekstraktado kun la sama volumeno de metanolo. Ĉelderompaĵoj estis forigitaj per centrifugado. La metanolo de ambaŭ ekstraktadoj estis kombinita kaj sekigita sub nitrogena fluo, poste resuspendita en la jenaj volumoj de 80% metanolo en akvo: cetero de la korpo, 50 µl; MAG-oj kaj ina LRT, 30 µl.
Specimenoj estis analizitaj per masspektrometro (ID-X, Thermo Fisher) kunligita al LC-instrumento (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl da specimeno estis injektitaj sur 3 µm, 100 × 4.6 mm kolonon (Inspire C8, Dikma) konservitan je 25 °C. La moveblaj fazoj por la LC estis A (akvo, 0.1% formika acido) kaj B (acetonitrilo, 0.1% formika acido). La LC-gradiento estis jena: 5% B dum 1 minuto, poste pliigita al 100% B dum 11 minutoj. Post 8 minutoj je 100%, reekvilibrigi la kolonon je 5% B dum 4 minutoj. La flukvanto estis 0.3 ml min-1. Jonigo en la MS-fonto estas plenumata per varmigita elektrospraja jonigo en pozitivaj kaj negativaj reĝimoj.
La masspektrometro mezuras datumojn en la m/z-intervalo de 350 ĝis 680 je 60.000-a rezolucio en plena MS-reĝimo. MS/MS-datumoj estis akiritaj sur [M + H]+ (ĉiuj celoj), [M - H2O + H]+ (ĉiuj celoj), kaj [M - H]- (fosforiligitaj celoj). MS/MS-datumoj estis uzitaj por konfirmi la ekdisonajn ecojn de celoj por kiuj neniu normo estis havebla. Por identigi ne-celitajn ekdisteroidojn, MS/MS-datumoj por ĉiuj HPLC-pintoj kun >15% relativa abundeco estis analizitaj. Kvantigu uzante normajn kurbojn kreitajn el puraj normoj (20E, 3D20E) por kalkuli absolutajn kvantojn aŭ diluojn de unu specifa specimeno (ĉiuj aliaj celoj) por kalkuli ilian ekvivalentecon al la kvantoj trovitaj en unu masklo. Por 3D20E, kvantigo estis farita uzante la sumon de la jenaj aduktoj: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Datumoj estis ĉerpitaj kaj kvantigitaj uzante Tracefinder (versio 4.1). MS/MS-datumoj estis analizitaj uzante Xcalibur (versio 4.4). La MS-spektroj de E, 20E kaj 3D20E estis komparitaj kun la respektivaj normoj. 3D20E22P estis analizita per derivado kun la reakciilo de Girard. 20E22P estis analizita per la m/z-proporcio.
3D20E22P estis purigita el MAG. Purigado estis efektivigita je analiza skalo uzante ultra-efikecan likvan kromatografon (Acquity, Waters) kun kvadrupola mas-bazita detektilo (QDa, Acquity, Waters) sub la samaj LC-kondiĉoj kiel la HPLC-MS/MS-analizo. Frakcia kolekto estis ekigita kiam la m/z korespondanta al 3D20E22P estis detektita je la sama retentempo kiel antaŭe determinita. La pureco de la ekstraktitaj kombinaĵoj estis poste kontrolita per HPLC-MS/MS kiel priskribite supre.
Totala RNA estis ekstraktita el 10-12 reproduktaj histoj aŭ aliaj korpopartoj (senkapaj) uzante TRI-reakciaĵon (Thermo Fisher) laŭ la instrukcioj de la fabrikanto. RNA estis traktita per TURBO DNase (Thermo Fisher). cDNA estis sintezita uzante Moloney-musan leŭkemian virusan inversan transkriptazon (M-MLV RT; Thermo Fisher) laŭ la instrukcioj de la fabrikanto. Enkondukoj por inversa transskriba kvanta PCR (RT-qPCR; Etendita Datuma Tabelo 2) estis antaŭe publikigitaj24 aŭ desegnitaj uzante Primer-BLAST26, kun prefero donita al produktoj de 70-150 bp grandeco kaj ampleksantaj ekson-eksonajn kruciĝojn aŭ enkondukajn parojn por apartaj eksonoj. cDNA-specimenoj de tri ĝis kvar biologiaj ripetoj estis diluitaj kvaroble en akvo por RT-qPCR. Kvantigo estis farita en 15 µl da ripetaj reakcioj enhavantaj 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), enkondukojn kaj 5 µl da diluita cDNA. Reakcioj estis funkciigitaj sur QuantStudio 6 Pro. realtempa PCR-sistemo (Thermo Fisher) kaj datumoj estis kolektitaj kaj analizitaj uzante Dezajnon kaj Analizon (versio 2.4.3). Kiel montrite en ĉi tiu studo, relativaj kvantoj estis normaligitaj al la ribosoma geno RpL19 (AGAP004422), kies esprimo ne ŝanĝiĝis signife kun sangonutrado27 aŭ pariĝado3.
La kvalito de RNA estis kontrolita per Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Bibliotekoj de Illumina kun paroj estis preparitaj kaj funkciigitaj ĉe la Broad Institute de MIT kaj Harvard. Sekvenclegaĵoj estis vicigitaj al la genaro de A. gambiae (PEST-bakteriaro, versio 4.12) uzante HISAT2 (versio 2.0.5) kun defaŭltaj parametroj. Legaĵoj kun mapada kvalito (MAPQ) poentaroj <30 estis forigitaj uzante Samtools (versio 1.3.1). La nombro de legaĵoj mapitaj al genoj estis kalkulita uzante htseq-count (versio 0.9.1) kun defaŭltaj parametroj. Normaligitaj legkalkuloj estis kalkulitaj kaj diferenciga genekspresio analizita uzante la pakaĵon DESeq2 (versio 1.28.1) en R (versio 4.0.3).
Ecdison-modifantaj genkandidatoj estis identigitaj per unue serĉado de la A. gambiae genaro uzante la PSI-BLAST algoritmon (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), uzante defaŭltajn valorojn Parametroj kun la jenaj serĉproteinsekvencoj: de Bombyx mori (Alirnumero NP_001038956.1), Musca domestica (Alirnumero XP_005182020.1, XP_005175332.1 kaj XP_011294434.1) kaj Microplitis demolitor (Alirnumero XP_008552646.1 kaj XP_008552645.1) EcK de B. mori (Alirnumero NP_001036900), Drosophila melanogaster (Alirnumero NP_651202), Apis mellifera (Alirnumero XP_394838) kaj Acyrthosiphon pisum (Alirnumero XP_001947166); kaj EPP de B. mori (Alirnumero XP_001947166) NP_001177919.1 kaj NP_001243996.1) kaj EO de D. melanogaster (Alirnumero NP_572986.1) (paŝo 1). Poste, filtru trafojn bazitajn sur alta mRNA-esprimo (>100 fragmentoj/kilobazaj eksonoj por miliono da mapitaj legaĵoj (FPKM) aŭ >85%) en genera histo (ina LRT aŭ MAG) en Gambio (paŝo 2). Por plibonigi specifecon, ni elektis kandidatenzimojn, kiuj ankaŭ esprimiĝas en la genera histo de A. albimanus, anofelspecio, kiu ne sintezas aŭ transdonas ekdizonon dum pariĝado. Kandidatgenoj estis filtritaj surbaze de malalta esprimo (<100 FPKM aŭ <85-a percentilo) en la genera histo de A. albimanus (paŝo 3). Kiel fina filtrilo (paŝo 4), kandidatgenoj devas plenumi almenaŭ unu el la jenaj: (1) signife plireguligitaj post pariĝado (P < 0,05) laŭ la analizo de diference esprimitaj genoj kaj (2) en ne-reproduktaj histoj (< 85 % aŭ <100 FPKM).
Ni modifis antaŭe priskribitajn metodojn 28,29,30 por atingi tut-organisman izotopan etikedadon. Mallonge, sovaĝ-tipa Saccharomyces cerevisiae tipo II (YSC2, Sigma) estis testita en gista nitrogena bazo (BD Difco, DF0335) enhavanta (pezo/volumo) 2% glukozon (G7528, Sigma), 1.7% sen aminoacidoj kaj amonian sulfaton (kulturmedion) kaj 5% 15N amonian sulfaton (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) kiel la solan fonton de nitrogeno. Gisto estis reakirita per centrifugado kaj moskitlarvoj estis nutritaj laŭvole ĝis krizalidiĝo. Suplementu per fiŝfaruno (0.5 mg por 300 larvoj) por malhelpi mortecon de la kvara instelo. Nur inoj estis poste uzitaj en pariĝaj eksperimentoj kun neetikeditaj maskloj por analizi la masklan proteomon transdonitan dum pariĝado.
4-6-tagaj 15N-etikeditaj virgaj inoj estis devigitaj pariĝi kun aĝ-kongruaj neetikeditaj virgaj maskloj. Sukcesa pariĝo estis kontrolita per detektado de pariĝaj ŝtopiloj sub epifluoreska mikroskopio. Je 3, 12 kaj 24 hppm, la atrioj de 45-55 pariĝintaj inoj estis dissekcitaj en 50 µl da amonia bikarbonata bufro (pH 7.8) kaj homogenigitaj per pistilo. La homogenato estis centrifugita kaj la supernatanto miksita kun 50 µl da 0.1% RapiGest (186001860, Waters) en 50 mM amonia bikarbonato. La supernatanto kaj buleto de ĉiu specimeno estis rapide frostigitaj sur seka glacio kaj senditaj dumnokte al la laboratorio MacCoss ĉe la Universitato de Vaŝingtonio, kie specimenpreparado por LC-MS/MS estis kompletigita. Resuspendu la buleton en 50 µl da 0.1% RapiGest en 50 mM amonia bikarbonato kaj sonikatu en akvobano. La proteina koncentriĝo de la peleto kaj supernatanto estis mezurita per la BCA-analizo, specimenoj estis reduktitaj per 5 mM ditiotreitolo (DTT; Sigma), alkilitaj per 15 mM jodoacetamido (Sigma) kaj inkubitaj je 37 °C (1:0 50) dum 1 horo kun tripsinigo: tripsino:substrata proporcio). RapiGest estis lizita per aldono de 200 mM HCl, sekvata de inkubacio je 37 °C dum 45 minutoj kaj centrifugado je 14,000 rpm dum 10 minutoj je 4 °C por forigi derompaĵojn. Specimenoj estis lavitaj per du-reĝima solid-faza ekstraktado (Oasis MCX-kartoĉoj, Waters) kaj resuspenditaj en 0.1% formika acido por fina proteina koncentriĝo de 0.33 µg µl-1. Neetikeditaj MAG-proteomoj estis simile analizitaj de virgaj maskloj. Du analizaj ripetoj estis analizitaj por ĉiu specimeno. Poste, 1 µg de ĉiu estis analizita uzante 25-cm³-an kolumnon el fandita silikoksido 75-μm kun 4-cm³-an fritkaptilon el fandita silikoksido Kasil1 (PQ) pakita per Jupiter C12 inversfaza rezino (Phenomenex) kaj 180-minutan likva kromatografion. Specimenaj digestoj - MS/MS estis funkciigita per Q-Exactive HF-masspektrometro (Thermo Fisher) kun nanoACQUITY UPLC-Sistemo (Waters). Datenrilataj akiraj datumoj generitaj por ĉiu kuro estis konvertitaj al mzML-formato uzante Proteowizard (versio 3.0.20287) kaj uzante Comet31 (versio 3.2) kontraŭ la FASTA-datumbazo enhavanta proteinajn sekvencojn de Anopheles gambiae (VectorBase versio 54), Anopheles coluzzi. Serĉo estis farita sur Mali-NIH (VectorBase versio 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, marto 2021), A. gambiae RNA-seq, kaj tri-kadraj tradukoj de konataj homaj poluaĵoj. Peptidmap-kongruaj FDR-oj estis determinitaj uzante Percolator32 (versio 3.05) kun sojlo de 0.01, kaj peptidoj estis kunmetitaj en proteinajn identigojn uzante proteinan ŝparemon en Limelight33 (versio 2.2.0). Relativa proteino La abundeco estis taksita uzante la normaligitan spektran abundecfaktoron (NSAF) kalkulitan por ĉiu proteino en ĉiu ciklo kiel antaŭe priskribite. NSAF relative al ĉiu proteino estis averaĝita trans specimenoj de du malsamaj biologiaj ripetoj. 15N-markado sukcese maskis la inan proteomon, kvankam malgranda kvanto da neetikedita proteino povus esti detektita de la etikeditaj virgulinoj. Ni registris detekton de maskla proteinredukto (1-5 spektroj) en inaj krudaj specimenoj nur en teknikaj cikloj, kie krudaj specimenoj estis kuritaj post masklaj/pariĝaj specimenoj, kiel rezulto de HPLC-"transporto". Fojaj proteinoj trovitaj kiel "poluantoj" de etikeditaj virgulinoj estas listigitaj en Aldona Tabelo 1.
Du antigenaj peptidoj, QTTDRVAPAPDQQQ (ene de izotipo PA) kaj MESDGTTPSGDSEQ (ene de izotipo PA kaj PB) en Genscript. La du peptidoj estis kombinitaj, poste konjugitaj al la transportproteino KLH kaj injektitaj en novzelandajn kuniklojn. La kunikloj estis oferitaj post la kvara injekto, kaj totala IgG estis izolita per afineca purigo. IgG de la plej EPP-specifa kuniklo estis uzata por plia okcidenta makulumado.
Por okcidentaj makuloj, MAG (n = 10, kie n reprezentas la nombron de biologie sendependaj moskitspecimenoj) kaj ina LRT (n = 30) de 4-tagaj virgaj maskloj kaj virgaj aŭ perforte parigitaj inoj (<10 post-pariĝado), proteina ekstrakta bufro (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% natria deoksikolato; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× proteaza inhibitora koktelo (Roche)) estis aldonitaj aparte. Specimenoj estis homogenigitaj tuj post dissekcio per perlpremilo (2 mm vitroperloj, 2,400 rpm, 90 sek). Nesolveblaj derompaĵoj estis forigitaj per centrifugado je 20,000 g je 4 °C. Proteinoj estis kvantigitaj per Bradford-analizo (Bio-Rad). Poste, 20 µg da MAG-proteino, 40 µg da LRT-proteino, kaj 20 µg da resta amasa proteino. estis denaturigitaj kaj apartigitaj per 10% Bis-Tris NuPAGE uzante MOPS-bufron. Proteinoj estis translokigitaj al polivinilidenfluoridaj membranoj uzante la iBlot2-translokigan sistemon (Thermo Fisher). Membranoj estis lavitaj dufoje en 1× PBS-T (0.1% Tween-20 en PBS) kaj poste blokitaj en Odyssey-bloka bufro (Li-Cor) dum 1 horo je 22°C. Membranoj estis skuitaj dumnokte je 4°C per kutima kunikla kontraŭ-EPP poliklona primara antikorpo (1:700 en bloka bufro) kaj rata kontraŭ-aktina monoklona primara antikorpo MAC237 (Abeam; 1:4,000). Membranoj estis lavitaj per PBS-T kaj poste kovitaj kun sekundaraj antikorpoj (azena kontraŭ-kunikla 800CW kaj kapra kontraŭ-rata 680LT (Li-Cor), ambaŭ 1:20,000) en bloka bufro enhavanta 0.01% SDS kaj 0.2% Tween-20 dum 1 horo. horon je 22 °C. Membranoj estis lavitaj per PBS-T kaj bildigitaj per skanilo Odyssey CLx. Bildoj estis kolektitaj kaj prilaboritaj en Image Studio (versio 5.2). Specifa bendo korespondanta al la izoformo EPP-RA (82 kDa) ne estis detektita.
La kodantaj regionoj de EPP (kiel izoformo AGAP002463-RB enhavanta histidina fosfatazan domajnon, NCBI konservita domajna serĉo 34) kaj EcK2 (AGAP002181) estis klonitaj en pET-21a(+) plasmidon (Novagen Millipore Sigma); La komenciloj estas listigitaj en la Plilongigita Datuma Tabelo 2. Ok GS4-ligiloj (en tandemo) estis enigitaj antaŭ la C-fina 6xHis-etikedo de la pET-21a(+)-EcK2-konstrukcio. Rekombinitaj proteinoj estis produktitaj uzante la NEBExpress-ĉel-liberan E. coli-proteinsintezan reakcion (New England BioLabs). Rekombinitaj proteinoj estis purigitaj uzante NEBExpress Ni-spinkolumnojn (New England BioLabs). Dihidrofolata reduktazo (DHFR) kontrolproteino estis produktita uzante DNA-ŝablonon de la NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit. Proteinoj estis konservitaj en 50% glicerolo en PBS je -20 °C dum ĝis 3 monatoj.
La fosfataza aktiveco de EPP kaj histaj ekstraktoj estis mezurita uzante 4-nitrofenilan fosfaton (pNPP; Sigma-Aldrich). La reakcia bufro enhavis 25 mM Tris, 50 mM acetatan acidon, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, kaj 1 mM DTT. La histo estis homogenigita en reakcia bufro kaj ĉelaj restaĵoj estis forigitaj per centrifugado. Komencu la reakcion aldonante enzimon aŭ histan ekstrakton al la reakcia bufro enhavanta 2.5 mg ml-1 pNPP. La reakcia miksaĵo estis inkubita je ĉambra temperaturo en mallumo, kaj la kvanto de pNP konvertita el pNPP estis kvantigita per mezurado de la absorbado je 405 nm je diversaj tempoj.
Por in vitro EcK-aktiveco, la proteino estis inkubita kun 0.2 mg da 20E aŭ 3D20E en 200 µl da bufrosolvaĵo (pH 7.5) enhavanta 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP kaj 10 mM MgCl2 dum 2 horoj je 27 °C. La reakcio estis haltigita per aldono de 800 µl da metanolo, poste malvarmigita je -20 °C dum 1 horo, poste centrifugita je 20,000 g dum 10 minutoj je 4 °C. La supernatant estis poste analizita per HPLC-MS/MS. Por varme-inaktivigi la proteinojn uzitajn en la kontrolgrupo, la proteinoj estis inkubitaj en 50% glicerolo en PBS dum 20 minutoj je 95 °C.
Por in vitro EPP-aktiveco, la proteino estis inkubita kun 3D20E22P (ekvivalenta al la kvanto trovita en 18 paroj de MAG, purigita per HPLC-MS/MS) en 100 µl da bufro (pH 7.5) enhavanta 25 mM Tris, 50 mM acetatan acidon, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, kaj 1 mM DTT dum 3 horoj je 27 °C. La reakcio estis haltigita per aldono de 400 µl da metanolo kaj malvarmigita je -20 °C dum 1 horo, poste centrifugita je 20,000 g dum 10 minutoj je 4 °C. La supernatanto estis analizita per HPLC-MS/MS.
PCR-fragmentoj por EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) kaj EcK2 (556 bp) estis amplifikitaj el cDNA preparita el miksseksaj senkapaj moskito-kadavroj. La PCR-fragmento de la eGFP-kontrolo (495 bp) estis amplifikita el la antaŭe priskribita pCR2.1-eGFP; PCR-enkondukoj estas listigitaj en Plilongigita Datuma Tabelo 2. La PCR-fragmento estis enigita inter la inversigitaj T7-enkondukoj sur la pL4440-plasmido. Plasmidaj konstrukcioj estis reakiritaj de NEB 5-α kompetenta E. coli (New England Biolabs) kaj kontrolitaj per DNA-sekvencado antaŭ uzo (vidu Suplementajn Datumojn 1 por enigita sekvenco). Enkondukoj kongruaj kun la T7-enkonduko (Plilongigita Datuma Tabelo 2) estis uzitaj por amplifiki la enigaĵon de la pL4440-bazita plasmido. La grandeco de PCR-produkto estis konfirmita per agaroza ĝela elektroforezo. La dsRNA estis transskribita de PCR-ŝablonoj uzante la Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) kaj purigita laŭ la instrukcioj de la fabrikanto kun la antaŭe priskribitaj modifoj.
Por dsRNA-injekto, 1,380 ng da dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) estis injektitaj je koncentriĝo de 10 ng nl-1 en la torakon de plenkreskaj maskloj aŭ inoj (Nanoject III, Drummond) ene de 1 tago post la eklozio. Genaj malaktivigaj niveloj estis determinitaj en almenaŭ tri biologiaj ripetoj per RNA-ekstraktado, cDNA-sintezo kaj RT-qPCR. Por ecdison-injekto, 4-tagajn virgajn aŭ 6-tagajn virgajn sangonutritajn inojn estis injektitaj per 0.13, 0.21 aŭ 0.63 µg da 20E aŭ 3D20E (Nanoject III, Drummond) je koncentriĝoj de 1.3, 2.1 respektive, depende de la eksperimenta dezajno, aŭ 6.3 ng nl-1. Injektu 100 nl da 10% (vol/vol) etanolo en akvo; 100 nl da 3D20E22P en 10% etanolo (ekvivalento al 75% de la kvanto trovita en paro da MAG-oj). Moskitoj estis hazarde asignitaj al la injektogrupo.
Por generaj provoj, 3-tagaj inoj estis manĝigitaj laŭvole per homa sango. Forigu parte manĝigitajn aŭ nemanĝitajn moskitojn. Depende de la traktado, inoj estis metitaj en apartajn generajn tasojn dum kvar noktoj almenaŭ 48 horojn post la sangomanĝo. Ovoj estis kalkulitaj sub stereoskopo (Stemi 508, Zeiss); por pariĝintaj inoj, ovoj kiuj eloviĝis en larvojn estis konsiderataj fekundaj.
Por pariĝaj provoj, inoj rajtis resti almenaŭ 2 tagojn depende de la traktado por evoluigi reziston al pariĝado, kaj sovaĝtipaj aĝ-kongruaj maskloj estis poste enkondukitaj en la saman kaĝon. Du noktojn poste, la inaj fekundigitaj veziketoj estis dissekcitaj kaj genomika DNA estis liberigita per frostigado-degelo kaj sonikado en bufro enhavanta 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, kaj 25 mM NaCl (pH 8.2). Specimenoj estis inkubaciitaj kun Proteinazo K (0.86 µg µl-1) dum 15 minutoj je 55 °C, sekvate de 10 minutoj je 95 °C. Krudaj genomikaj DNA-preparoj estis diluitaj 10-oble kaj submetitaj al qPCR-detekto de Y-kromosomaj sekvencoj; komenciloj estas listigitaj en Plilongigita Datuma Tabelo 2. Foresto de Y-kromosoma sekvenco indikas neniun pariĝadon.
Por re-pariĝaj provoj, perforte parigitaj inoj estis ekzamenitaj pri la ĉeesto de pariĝaj ŝtopiloj por konfirmi la pariĝan staton kaj permesitaj 2 tagojn por disvolvi rezistecon al pariĝado en la foresto de maskloj, kiel antaŭe priskribite 36. Maskloj portantaj DsRed-transgenan spermon estis poste enkondukitaj en inajn kaĝojn. Du noktojn poste, la fekundigaj veziketoj estis dissekcitaj de la inoj, kaj genomika DNA estis preparita kiel priskribite supre kaj submetita al qPCR-detekto de la DsRed-transgeno; komenciloj estas listigitaj en Plilongigita Datuma Tabelo 2. La foresto de la DsRed-transgeno indikis, ke neniu re-pariĝado okazis.
3D20E estis sintezita kiel antaŭe priskribite 37. Mallonge, 10 mg da 20E (Sigma-Aldrich) estis dissolvitaj en 10 ml da akvo, sekvate de aldono de 30 mg da platena nigra (en pulvora formo, Sigma-Aldrich). Milda fluo de O2 estis kontinue bobelita en la reakcian miksaĵon, kiu estis kirita je ĉambra temperaturo. Post 6 horoj, 30 mL da metanolo estis aldonitaj por haltigi la reakcion. La miksaĵo estis centrifugita por forigi katalizajn partiklojn. La supernatanto estis vaporigita ĝis sekeco en vakuo je ĉambra temperaturo. La sekigita reakcia produkto estis dissolvita en 10% etanolo kaj metanolo por injekto por HPLC-MS/MS-analizo. La konverta rapido (de 20E al 3D20E) estis proksimume 97% (Fig. 4b), kaj la MS-spektro de la sintezita 3D20E kongruis kun tiu trovita en pariĝintaj inoj (Fig. 4c).
La legendo enhavas specifajn detalojn pri la faritaj statistikaj testoj. GraphPad (versio 9.0) estis uzata por plenumi la precizan teston de Fisher, la teston de Mantel-Cox, kaj la t-teston de Student. Cochran-Mantel-Haenszel-testoj estis plenumitaj uzante kutiman R-skripton (havebla ĉe https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). La datumdistribuo estis testita pri normaleco uzante la Shapiro-Wilk-teston kun signifsojlo de 0.05. Kiam la datumoj malsukcesis la normalecan teston, la Mann-Whitney-testo estis plenumita. Supervivaj datumoj estis analizitaj uzante la Mantel-Cox-teston. La pakaĵo DESeq2 (versio 1.28.1) estis uzata por plenumi RNA-seq-gennivelan diferencigan espriman analizon. La horizontala stango sur la grafikaĵo reprezentas la medianon. Signifvaloro de P = 0.05 estis uzata kiel la sojlo por ĉiuj testoj.
Por pliaj informoj pri la studdezajno, vidu la resumon de Nature Research Report ligitan al ĉi tiu artikolo.
MS-proteomikaj datumoj estis deponitaj en la ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) per la PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) kun la datumar-identigilo PXD032157.
La RNA-seq datumbazo estas deponita en la Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) sub la seria registro GSE198665.
Pliaj datumaroj generitaj kaj/aŭ analizitaj dum la nuna studo povas esti akiritaj de la korespondaj aŭtoroj laŭ racia peto. Ĉi tiu artikolo provizas la fontajn datumojn.
De Loof, A. Ecdysteroidoj: Neglektitaj insektaj sekssteroidoj? Vira: Nigra Skatolo. Insekta Scienco. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hidroksiekdizono kaj ovaria disvolviĝo en Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).