Imunomodulaj metabolitoj estas ŝlosila trajto de la tumora mikromedio (TME), sed kun kelkaj esceptoj, iliaj identecoj restas plejparte nekonataj. Ĉi tie, ni analizis tumorojn kaj T-ĉelojn el la tumoroj kaj ascito de pacientoj kun altgrada seroza karcinomo (HGSC) por riveli la metabolomon de ĉi tiuj malsamaj TME-sekcioj. Ascito kaj tumorĉeloj havas ampleksajn diferencojn en metabolitoj. Kompare kun ascito, la tumor-infiltrantaj T-ĉeloj estas signife riĉigitaj je 1-metilnikotinamido (MNA). Kvankam la nivelo de MNA en T-ĉeloj estas levita, la esprimo de nikotinamida N-metiltransferazo (enzimo kiu katalizas la translokigon de metilgrupoj de S-adenozilmetionino al nikotinamido) estas limigita al fibroblastoj kaj tumorĉeloj. Funkcie, MNA induktas T-ĉelojn sekrecii la tumor-antaŭenigantan citokinon tumoran nekrozan faktoron alfa. Tial, TME-derivita MNA kontribuas al la imunoreguligo de T-ĉeloj kaj reprezentas eblan imunoterapian celon por la traktado de homa kancero.
Tumor-derivitaj metabolitoj povas havi profundan inhibician efikon sur kontraŭtumora imuneco, kaj pli kaj pli da evidenteco montras, ke ili ankaŭ povas servi kiel ŝlosila mova forto por malsanprogresado (1). Aldone al la Warburg-efiko, lastatempa laboro komencis karakterizi la metabolan staton de tumorĉeloj kaj ĝian rilaton kun la imuna stato de la tumora mikromedio (TME). Studoj pri musmodeloj kaj homaj T-ĉeloj montris, ke glutamina metabolo (2), oksidativa metabolo (3) kaj glukoza metabolo (4) povas agi sendepende sur diversaj imunĉelaj subgrupoj. Pluraj metabolitoj en ĉi tiuj vojoj inhibicias la kontraŭtumoran funkcion de T-ĉeloj. Estis pruvite, ke la blokado de la koenzimo tetrahidrobiopterino (BH4) povas damaĝi la proliferadon de T-ĉeloj, kaj la pliiĝo de BH4 en la korpo povas plifortigi la kontraŭtumoran imunan respondon mediaciitan de CD4 kaj CD8. Krome, la imunosupresa efiko de kinurenino povas esti savita per la administrado de BH4 (5). En izocitrato-dehidrogenazo (IDH) mutacianta glioblastomo, la sekrecio de enantiometabola (R)-2-hidroksiglutarato (R-2-HG) inhibicias T-ĉelan aktivigon, proliferadon kaj citolizan agadon (6). Lastatempe, oni montris, ke metilglioksalo, kromprodukto de glikolizo, estas produktita de subpremantaj ĉeloj de mieloida origino, kaj T-ĉela translokigo de metilglioksalo povas inhibicii efektoran T-ĉelan funkcion. En kuracado, la neŭtraligo de metilglioksalo povas superi la agadon de mieloid-derivitaj subpremantaj ĉeloj (MDSC) kaj sinergie plifortigi kontrolpunktan blokan terapion en musmodeloj (7). Ĉi tiuj studoj kolektive emfazas la ŝlosilan rolon de TME-derivitaj metabolitoj en reguligo de T-ĉela funkcio kaj agado.
Misfunkcio de T-ĉeloj estis vaste raportita en ovaria kancero (8). Ĉi tio parte ŝuldiĝas al la metabolaj karakterizaĵoj enecaj en hipoksio kaj nenormala tumora angiaro (9), kiu rezultas en la konvertiĝo de glukozo kaj triptofano en kromproduktojn kiel lakta acido kaj kinurenino. Troa eksterĉela laktato reduktas la produktadon de interferono-γ (IFN-γ) kaj pelas la diferenciĝon de mielosupresivaj subgrupoj (10, 11). La konsumo de triptofano rekte inhibas T-ĉelan proliferadon kaj inhibas T-ĉelan receptoran signaladon (12-14). Malgraŭ ĉi tiuj observoj, multe da laboro ĉirkaŭ imuna metabolo estis farita en in vitro T-ĉela kulturo uzante optimumigitajn mediojn, aŭ limigita al homologaj musmodeloj in vivo, nek el kiuj plene reflektas la diversecon de homaj kanceroj kaj fiziologiajn makro- kaj mikro-mediojn.
Komuna trajto de ovaria kancero estas peritonea disvastiĝo kaj la apero de ascito. La amasiĝo de ĉellikvaĵo en ascito estas asociita kun progresinta malsano kaj malbona prognozo (15). Laŭ raportoj, ĉi tiu unika kompartmento estas hipoksika, havas altajn nivelojn de vaskula endotela kreskofaktoro (VEGF) kaj indoleamina 2,3-dioksigenazo (IDO), kaj estas infiltrita de T-reguligaj ĉeloj kaj mieloidaj inhibiciaj ĉeloj (15-18). La metabola medio de ascito povas esti malsama ol tiu de la tumoro mem, do la reprogramado de T-ĉeloj en la peritonea spaco estas neklara. Krome, la ŝlosilaj diferencoj kaj diverseco inter ascito kaj metabolitoj ĉeestantaj en la tumora medio povas malhelpi la enfiltriĝon de imunĉeloj kaj ilian funkcion sur tumoroj, kaj plia esplorado estas necesa.
Por solvi ĉi tiujn problemojn, ni desegnis senteman metodon de ĉelapartigo kaj likva kromatografio per tandema maso-spektrometrio (LC-MS/MS) por studi malsamajn ĉeltipojn (inkluzive de CD4+ kaj CD8+ T-ĉeloj) same kiel ene de kaj inter tumoroj. Ĝiaj metabolitoj etendiĝas tra ĉeloj en la sama ascito kaj tumora medio de la paciento. Ni uzas ĉi tiun metodon kune kun alt-dimensia fluocitometrio kaj unu-ĉela RNA-sekvencado (scRNA-sekvencado) por provizi alt-solvitan portreton de la metabola stato de ĉi tiuj ŝlosilaj populacioj. Ĉi tiu metodo rivelis signifan pliiĝon en la nivelo de 1-metilnikotinamido (MNA) en tumoraj T-ĉeloj, kaj en vitro eksperimentoj montris, ke la imunomodula efiko de MNA sur T-ĉela funkcio antaŭe estis nekonata. Ĝenerale, ĉi tiu metodo malkaŝas la reciprokajn metabolajn interagojn inter tumoroj kaj imunĉeloj, kaj provizas unikajn komprenojn pri imunoreguligaj metabolitoj, kiuj povas esti utilaj por la traktado de T-ĉel-bazita ovaria kancera imunoterapio. Traktadaj ŝancoj.
Ni uzis alt-dimensian fluocitometrion por samtempe kvantigi glukozan asimiladon [2-(N-(7-nitrofenil-2-oksa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-deoksiglukozo (2-NBDG) kaj mitokondrian aktivecon [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) estas apudaj tipaj markiloj, kiuj distingas imunĉelojn kaj tumorĉelajn populaciojn (Tabelo S2 kaj Figuro S1A). Ĉi tiu analizo montris, ke kompare kun T-ĉeloj, ascito kaj tumorĉeloj havas pli altajn glukozajn asimilajn nivelojn, sed havas pli malgrandajn diferencojn en mitokondria aktiveco. La averaĝa glukoza asimilado de tumorĉeloj [CD45-EpCAM (EpCAM)+] estas tri- ĝis kvar-obla ol tiu de T-ĉeloj, kaj la averaĝa glukoza asimilado de CD4+ T-ĉeloj estas 1.2-obla ol tiu de CD8+ T-ĉeloj, kio indikas, ke tumoro-infiltrantaj limfocitoj (TIL) havas malsamajn metabolajn bezonojn eĉ en la sama TME (Figuro 1A). Kontraste, la mitokondria aktiveco en tumorĉeloj similas al tiu de CD4+ T-ĉeloj, kaj la mitokondria aktiveco de ambaŭ ĉeltipoj estas pli alta ol tiu de CD8+ T-ĉeloj (Figuro 1B). Ĝenerale, ĉi tiuj rezultoj malkaŝas la metabolan nivelon. La metabola aktiveco de tumorĉeloj estas pli alta ol tiu de CD4+ T-ĉeloj, kaj la metabola aktiveco de CD4+ T-ĉeloj estas pli alta ol tiu de CD8+ T-ĉeloj. Malgraŭ ĉi tiuj efikoj trans ĉeltipoj, ne ekzistas kohera diferenco en la metabola stato de CD4+ kaj CD8+ T-ĉeloj aŭ iliaj relativaj proporcioj en ascito kompare kun tumoroj (Figuro 1C). Kontraste, en la CD45-ĉela frakcio, la proporcio de EpCAM+ ĉeloj en la tumoro pliiĝis kompare kun ascito (Figuro 1D). Ni ankaŭ observis klaran metabolan diferencon inter EpCAM+ kaj EpCAM- ĉelaj komponantoj. EpCAM+ (tumoro) ĉeloj havas pli altan glukozan asimiladon kaj mitokondrian aktivecon ol EpCAM- ĉeloj, kio estas multe pli alta ol la metabola aktiveco de fibroblastoj en tumorĉeloj en TME (Figuro 1, E kaj F).
(A kaj B) Mediana fluoreska intenseco (MFI) de glukoza asimilado (2-NBDG) (A) kaj mitokondria aktiveco de CD4+ T-ĉeloj (MitoTracker malhelruĝa) (B) Reprezentaj grafikaĵoj (maldekstre) kaj tabelitaj datumoj (dekstre), CD8+ T-ĉeloj kaj EpCAM+ CD45-tumoraj ĉeloj el ascito kaj tumoro. (C) La proporcio de CD4+ kaj CD8+ ĉeloj (el CD3+ T-ĉeloj) en ascito kaj tumoro. (D) Proporcio de EpCAM+ tumoraj ĉeloj en ascito kaj tumoro (CD45−). (E kaj F) EpCAM+ CD45-tumoro kaj EpCAM-CD45-matrica glukoza asimilado (2-NBDG) (E) kaj mitokondria aktiveco (MitoTracker malhelruĝa) (F) reprezentaj grafikaĵoj (maldekstre) kaj tabelitaj datumoj (dekstre) Ascito kaj tumoraj ĉeloj. (G) Reprezentaj grafikaĵoj de CD25, CD137 kaj PD1 esprimo per fluocitometrio. (H kaj I) CD25, CD137 kaj PD1 esprimo sur CD4+ T-ĉeloj (H) kaj CD8+ T-ĉeloj (I). (J kaj K) Naivaj, centra memoro (Tcm), efektora (Teff) kaj efektora memoro (Tem) fenotipoj bazitaj sur la esprimo de CCR7 kaj CD45RO. Reprezentaj bildoj (maldekstre) kaj tabelaj datumoj (dekstre) de CD4+ T-ĉeloj (J) kaj CD8+ T-ĉeloj (K) en ascito kaj tumoroj. P-valoroj determinitaj per parigita t-testo (*P<0,05, **P<0,01 kaj ***P<0,001). La linio reprezentas kongruajn pacientojn (n = 6). FMO, fluoreskeco minus unu; MFI, mediana fluoreskeca intenseco.
Plia analizo rivelis aliajn signifajn diferencojn inter la tre solvita fenotipa stato de T-ĉeloj. La aktivigitaj (Figuro 1, G ĝis I) kaj efektora memoro (Figuro 1, J kaj K) en tumoroj estas multe pli oftaj ol en ascito (proporcio de CD3+ T-ĉeloj). Simile, analizo de la fenotipo per la esprimo de aktivigaj markiloj (CD25 kaj CD137) kaj malpliigaj markiloj [programita ĉelmorta proteino 1 (PD1)] montris, ke kvankam la metabolaj karakterizaĵoj de ĉi tiuj populacioj estas malsamaj (Figuro S1, B ĝis E), neniuj signifaj metabolaj diferencoj estis konstante observitaj inter naivaj, efektoraj aŭ memoraj subaroj (Figuro S1, F ĝis I). Ĉi tiuj rezultoj estis konfirmitaj per maŝinlernadaj metodoj por aŭtomate asigni ĉelajn fenotipojn (21), kio plue rivelis la ĉeeston de granda nombro da ostamedolaj ĉeloj (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) en la ascito de la paciento (Figuro S2A). Inter ĉiuj identigitaj ĉeltipoj, ĉi tiu mieloida ĉelpopulacio montris la plej altan glukozan asimiladon kaj mitokondrian agadon (Figuro S2, B ĝis G). Ĉi tiuj rezultoj elstarigas la fortajn metabolajn diferencojn inter la multoblaj ĉeltipoj trovitaj en ascito kaj tumoroj en HGSC-pacientoj.
La ĉefa defio en komprenado de la metabolaj karakterizaĵoj de TIL estas la bezono izoli T-ĉelajn specimenojn de sufiĉa pureco, kvalito kaj kvanto el tumoroj. Lastatempaj studoj montris, ke ordigaj kaj perlo-riĉigaj metodoj bazitaj sur fluocitometrio povas konduki al ŝanĝoj en ĉelaj metabolitaj profiloj (22-24). Por superi ĉi tiun problemon, ni optimumigis la perlo-riĉigan metodon por izoli kaj izoli TIL el kirurgie resekcio de homa ovaria kancero antaŭ analizo per LC-MS/MS (vidu Materialojn kaj Metodojn; Figuro 2A). Por taksi la ĝeneralan efikon de ĉi tiu protokolo sur metabolitajn ŝanĝojn, ni komparis la metabolitajn profilojn de T-ĉeloj aktivigitaj de sanaj donacantoj post la supre menciita perlo-apartiga paŝo kun ĉeloj, kiuj ne estis perlo-apartigitaj sed restis sur glacio. Ĉi tiu kvalitkontrola analizo trovis, ke ekzistas alta korelacio inter ĉi tiuj du kondiĉoj (r = 0.77), kaj la teknika ripeteblo de la grupo de 86 metabolitoj havas altan ripeteblon (Figuro 2B). Tial, ĉi tiuj metodoj povas plenumi precizan analizon de metabolitoj en ĉeloj spertantaj ĉeltipan riĉigon, tiel provizante la unuan alt-rezolucian platformon por identigi specifajn metabolitojn en HGSC, tiel ebligante al homoj akiri pli profundan komprenon pri ĉelspecifeco en la seksa metabolprogramo.
(A) Skema diagramo de magneta perlriĉigo. Antaŭ analizo per LC-MS/MS, la ĉeloj spertos tri sinsekvajn rondojn de magneta perlriĉigo aŭ restos sur glacio. (B) La efiko de la riĉiga tipo sur la abundo de metabolitoj. La averaĝo de tri mezuradoj por ĉiu riĉiga tipo ± SE. La griza linio reprezentas rilaton 1:1. La intraklasa korelacio (ICC) de ripetaj mezuradoj montrita en la aksa etikedo. NAD, nikotinamida adenina dinukleotido. (C) Skema diagramo de la laborfluo de analizo de pacientaj metabolitoj. Ascito aŭ tumoroj estas kolektitaj de pacientoj kaj kriokonservitaj. Malgranda parto de ĉiu specimeno estis analizita per fluocitometrio, dum la ceteraj specimenoj spertis tri rondojn de riĉigo por CD4+, CD8+ kaj CD45- ĉeloj. Ĉi tiuj ĉelfrakcioj estis analizitaj per LC-MS/MS. (D) Varma mapo de normigita metabolita abundo. La dendrogramo reprezentas la Ward-grupigon de eŭklidaj distancoj inter specimenoj. (E) Analizo de ĉefaj komponantoj (AĈP) de mapo de metabolitoj en specimenoj, montrante tri ripetojn de ĉiu specimeno, specimenoj de la sama paciento estas konektitaj per linio. (F) La AĈP de la metabolita profilo de la specimeno kondiĉigita sur la paciento (t.e., uzante partan redundon); la specimena tipo estas limigita de la konveksa koverto. AĈP1, ĉefa komponanto 1; AĈP2, ĉefa komponanto 2.
Poste, ni aplikis ĉi tiun riĉigmetodon por analizi 99 metabolitojn en la CD4+, CD8+ kaj CD45-ĉelaj frakcioj en la primaraj ascito kaj tumoroj de ses HGSC-pacientoj (Figuro 2C, Figuro S3A kaj Tabelo S3 kaj S4). La interesa populacio konsistigas 2% ĝis 70% de la originala granda specimeno de vivantaj ĉeloj, kaj la proporcio de ĉeloj varias multe inter pacientoj. Post apartigo de la globetoj, la riĉigita frakcio de intereso (CD4+, CD8+ aŭ CD45-) konsistigas averaĝe pli ol 85% de ĉiuj vivantaj ĉeloj en la specimeno. Ĉi tiu riĉigmetodo permesas al ni analizi ĉelajn populaciojn el homa tumora hista metabolo, kio estas neeble farebla el grandaj specimenoj. Uzante ĉi tiun protokolon, ni determinis, ke l-kinurenino kaj adenozino, ĉi tiuj du bone karakterizitaj imunosupresivaj metabolitoj, estis levitaj en tumoraj T-ĉeloj aŭ tumorĉeloj (Figuro S3, B kaj C). Tial, ĉi tiuj rezultoj montras la fidelecon kaj kapablon de nia ĉelapartiga kaj masspektrometria teknologio trovi biologie gravajn metabolitojn en pacientaj histoj.
Nia analizo ankaŭ rivelis fortan metabolan apartigon de ĉeltipoj ene de kaj inter pacientoj (Figuro 2D kaj Figuro S4A). Aparte, kompare kun aliaj pacientoj, paciento 70 montris malsamajn metabolajn karakterizaĵojn (Figuro 2E kaj Figuro S4B), indikante ke eble ekzistas konsiderinda metabola diverseco inter pacientoj. Indas rimarki, ke kompare kun aliaj pacientoj (1,2 ĝis 2 litroj; Tabelo S1), la tuta kvanto da ascito kolektita en paciento 70 (80 ml) estis pli malgranda. La kontrolo de interpacienta diverseco dum analizo de ĉefaj komponantoj (ekzemple, uzante partan redundancan analizon) montras konsekvencajn ŝanĝojn inter ĉeltipoj, kaj la ĉeltipoj kaj/aŭ mikromedio estas klare agregitaj laŭ la metabolita profilo (Figuro 2F). La analizo de unuopaj metabolitoj emfazis ĉi tiujn efikojn kaj rivelis signifajn diferencojn inter ĉeltipoj kaj mikromedio. Indas rimarki, ke la plej ekstrema observita diferenco estas MNA, kiu kutime estas riĉigita en CD45-ĉeloj kaj en CD4+ kaj CD8+ ĉeloj, kiuj infiltras la tumoron (Figuro 3A). Por CD4+ ĉeloj, ĉi tiu efiko estas plej evidenta, kaj la MNA en CD8+ ĉeloj ankaŭ ŝajnas esti forte influita de la ĉirkaŭaĵo. Tamen, ĉi tio ne gravas, ĉar nur tri el la ses pacientoj povas esti taksitaj laŭ tumoraj CD8+ poentaroj. Aldone al MNA, en malsamaj specoj de ĉeloj en ascito kaj tumoroj, aliaj metabolitoj, kiuj estas malbone karakterizitaj en TIL, ankaŭ estas diference riĉaj (Figuroj S3 kaj S4). Tial, ĉi tiuj datumoj malkaŝas promesplenan aron de imunomodulaj metabolitoj por plia esplorado.
(A) Normaligita enhavo de MNA en CD4+, CD8+ kaj CD45- ĉeloj el ascito kaj tumoro. La kesta diagramo montras la medianon (linion), interkvartilan intervalon (kadroĉarniro) kaj datenintervalon, ĝis 1.5-oble la interkvartilan intervalon (kadroharniro). Kiel priskribite en Pacientaj Materialoj kaj Metodoj, uzu la limma valoron de la paciento por determini la P-valoron (*P<0.05 kaj **P<0.01). (B) Skema diagramo de MNA-metabolo (60). Metabolitoj: S-adenozil-1-metionino; SAH, S-adenozino-1-homocisteino; NA, nikotinamido; MNA, 1-metilnikotinamido; 2-PY, 1-metil-2-piridono-5-karboksamido; 4-PY, 1-metil-4-piridono-5-karboksamido; NR, nikotinamida ribozo; NMN, nikotinamida mononukleotido. Enzimoj (verdaj): NNMT, nikotinamida N-metiltransferazo; SIRT, sirtuinoj; NAMPT, nikotinamida fosforibosiltransferazo; AOX1, aldehida oksidazo 1; NRK, nikotinamida ribosida kinazo; NMNAT, nikotinamida mononukleotida adenilattransferazo; Pnp1, purina nukleozida fosforilazo. (C) t-SNE de scRNA-sekvenco de ascito (griza) kaj tumoro (ruĝa; n = 3 pacientoj). (D) NNMT-esprimo en malsamaj ĉelpopulacioj identigitaj uzante scRNA-sekvencon. (E) Esprimo de NNMT kaj AOX1 en SK-OV-3, homa embria reno (HEK) 293T, T-ĉeloj kaj MNA-traktitaj T-ĉeloj. La faldita esprimo estas montrita relative al SK-OV-3. La esprimpadrono per SEM estas montrita (n = 6 sanaj donacantoj). Ct-valoroj pli grandaj ol 35 estas konsiderataj nedetekteblaj (UD). (F) Esprimo de SLC22A1 kaj SLC22A2 en SK-OV-3, HEK293T, T-ĉeloj kaj T-ĉeloj traktitaj per 8mM MNA. La faldita esprimo estas montrita rilate al SK-OV-3. La esprimpadrono per SEM estas montrita (n = 6 sanaj donacantoj). Ct-valoroj pli grandaj ol 35 estas konsiderataj nedetekteblaj (UD). (G) Ĉela MNA-enhavo en aktivigitaj sanaj donacantaj T-ĉeloj post 72 horoj da inkubacio kun MNA. La esprimpadrono per SEM estas montrita (n = 4 sanaj donacantoj).
MNA estas produktita per translokigo de la metilgrupo de S-adenosil-1-metionino (SAM) al nikotinamido (NA) per nikotinamida N-metiltransferazo (NNMT; Figuro 3B). NNMT estas troesprimita en diversaj homaj kanceroj kaj estas asociita kun proliferado, invado kaj metastazo (25-27). Por pli bone kompreni la fonton de MNA en T-ĉeloj en TME, ni uzis scRNA-sekvencon por karakterizi la esprimon de NNMT trans ĉeltipoj en la ascito kaj tumoroj de tri HGSC-pacientoj (Tabelo S5). Analizo de proksimume 6 500 ĉeloj montris, ke en ascito kaj tumoraj medioj, NNMT-esprimo estis limigita al la supozeblaj fibroblastaj kaj tumorĉelaj populacioj (Figuro 3, C kaj D). Indas rimarki, ke ne ekzistas evidenta NNMT-esprimo en iu ajn populacio, kiu esprimas PTPRC (CD45+) (Figuro 3D kaj Figuro S5A), kio indikas, ke la MNA detektita en la metabolita spektro estis enkondukita en T-ĉelojn. La esprimo de aldehida oksidazo 1 (AOX1) konvertas MNA en 1-metil-2-piridono-5-karboksamidon (2-PYR) aŭ 1-metil-4-piridono-5-karboksamidon (4-PYR); Figuro 3B) ankaŭ estas limigita al la populacio de fibroblastoj esprimantaj COL1A1 (Figuro S5A), kiuj kune indikas, ke al T-ĉeloj mankas la kapablo je konvencia MNA-metabolo. La esprima ŝablono de ĉi tiuj MNA-rilataj genoj estis kontrolita uzante duan sendependan ĉelan datumaron de ascito de HGSC-pacientoj (Figuro S5B; n = 6) (16). Krome, kvanta polimeraza ĉenreakcio (qPCR) analizo de sanaj donacaj T-ĉeloj traktitaj per MNA montris, ke kompare kun kontrolaj SK-OV-3 ovariaj tumorĉeloj, NNMT aŭ AOX1 preskaŭ ne estis esprimitaj (Figuro 3E). Ĉi tiuj neatenditaj rezultoj indikas, ke MNA povas esti sekreciita de fibroblastoj aŭ tumoroj en apudajn T-ĉelojn en TME.
Kvankam kandidatoj inkluzivas la familion de organikaj katjonaj transportiloj 1 ĝis 3 (OCT1, OCT2 kaj OCT3) koditaj de la solvebla transportilo 22 (SLC22) familio (SLC22A1, SLC22A2 kaj SLC22A3), la eblaj transportiloj de MNA estas ankoraŭ nedifinitaj (28). QPCR de mRNA de sanaj donacaj T-ĉeloj montris malaltajn esprimnivelojn de SLC22A1 sed nerimarkeblajn nivelojn de SLC22A2, kio konfirmis, ke ĝi estis antaŭe raportita en la literaturo (Figuro 3F) (29). Kontraste, la SK-OV-3 ovaria tumorĉellinio esprimis altajn nivelojn de ambaŭ transportiloj (Figuro 3F).
Por testi la eblecon, ke T-ĉeloj havas la kapablon absorbi fremdan MNA-on, sanaj donacantaj T-ĉeloj estis kultivitaj dum 72 horoj en la ĉeesto de malsamaj koncentriĝoj de MNA. En la foresto de eksogena MNA, la ĉela enhavo de MNA ne povas esti detektita (Figuro 3G). Tamen, aktivigitaj T-ĉeloj traktitaj per eksogena MNA montris doz-dependan pliiĝon de MNA-enhavo en la ĉeloj, ĝis 6 mM MNA (Figuro 3G). Ĉi tiu rezulto indikas, ke malgraŭ la malalta nivelo de transportila esprimo kaj manko de la ĉefa enzimo respondeca pri intraĉela MNA-metabolo, TIL ankoraŭ povas absorbi MNA-on.
La spektro de metabolitoj en la T-ĉeloj de pacientoj kaj en vitro MNA-sorbaj eksperimentoj pliigas la eblecon, ke kancer-rilataj fibroblastoj (CAF) sekrecias MNA, kaj tumorĉeloj povus reguligi la fenotipon kaj funkcion de TIL. Por determini la efikon de MNA sur T-ĉelojn, sanaj donacantaj T-ĉeloj estis aktivigitaj en vitro en la ĉeesto aŭ foresto de MNA, kaj ilia proliferado kaj citokina produktado estis taksitaj. Post 7 tagoj da aldono de MNA je la plej alta dozo, la nombro de duobligoj de la populacio estis modere reduktita, dum vigleco estis konservita ĉe ĉiuj dozoj (Figuro 4A). Krome, traktado de eksogena MNA rezultigis pliiĝon en la proporcio de CD4+ kaj CD8+ T-ĉeloj esprimantaj tumoran nekrozan faktoron-α (TNFα; Figuro 4B). Kontraste, la intraĉela produktado de IFN-γ estis signife reduktita en CD4+ T-ĉeloj, sed ne en CD8+ T-ĉeloj, kaj ne estis signifa ŝanĝo en interleukin 2 (IL-2; Figuro 4, C kaj D). Tial, enzim-ligita imunosorba analizo (ELISA) de supernatantoj de ĉi tiuj MNA-traktitaj T-ĉelaj kulturoj montris signifan pliiĝon de TNFα, malpliiĝon de IFN-γ, kaj neniun ŝanĝon en IL-2 (Figuro 4, E ĝis G). La malpliiĝo de IFN-γ indikas, ke MNA povus ludi rolon en inhibicio de la kontraŭtumora agado de T-ĉeloj. Por simuli la efikon de MNA sur T-ĉel-mediaciitan citotoksecon, ĥimeraj antigenaj receptoraj T (FRα-CAR-T) ĉeloj celantaj folatan receptoron α kaj CAR-T (GFP) reguligitaj de verdaj fluoreskaj proteinoj (GFP) -CAR-T) ĉeloj estas produktitaj de sanaj donacaj periferiaj sangaj mononukleaj ĉeloj (PBMC). CAR-T ĉeloj estis kultivitaj dum 24 horoj en la ĉeesto de MNA, kaj poste kunkultivitaj kun homaj SK-OV-3 ovariaj tumorĉeloj esprimantaj folatan receptoron α je efektoro-celo-proporcio de 10:1. MNA-traktado rezultigis signifan malpliiĝon de la mortiga agado de FRα-CAR-T-ĉeloj, kio similis al FRα-CAR-T-ĉeloj traktitaj per adenozino (Figuro 4H).
(A) Totala nombro de vivkapablaj ĉeloj kaj duobligo de la populacio (PD) rekte el la kulturo je la 7a tago. La stanggrafikaĵo reprezentas la meznombron + SEM de ses sanaj donacantoj. Reprezentas datumojn de almenaŭ n = 3 sendependaj eksperimentoj. (B ĝis D) CD3/CD28 kaj IL-2 estis uzitaj por aktivigi T-ĉelojn je iliaj respektivaj MNA-koncentriĝoj dum 7 tagoj. Antaŭ la analizo, la ĉeloj estis stimulitaj per PMA/jonomicino kun GolgiStop dum 4 horoj. TNFα (B) esprimo en T-ĉeloj. Ekzempla bildo (maldekstre) kaj tabelaj datumoj (dekstre) pri TNFα esprimo en vivantaj ĉeloj. IFN-γ (C) kaj IL-2 (D) esprimo en T-ĉeloj. La esprimo de citokinoj estis mezurita per fluocitometrio. La stanggrafikaĵo reprezentas la meznombron (n = 6 sanaj donacantoj) + SEM. Uzu unudirektan variancan analizon kaj ripetajn mezurojn (*P<0,05 kaj **P<0,01) por determini la P-valoron. Reprezentas datumojn de almenaŭ n = 3 sendependaj eksperimentoj. (E ĝis G) CD3/CD28 kaj IL-2 estis uzitaj por aktivigi T-ĉelojn je iliaj respektivaj MNA-koncentriĝoj dum 7 tagoj. La medio estis kolektita antaŭ kaj post 4 horoj da PMA/jonomicina stimulo. La koncentriĝoj de TNFα (E), IFN-γ (F) kaj IL-2 (G) estis mezuritaj per ELISA. La stangdiagramo reprezentas la meznombron (n = 5 sanaj donacantoj) + SEM. P-valoro determinita uzante unudirektan variancan analizon kaj ripetajn mezuradojn (*P<0.05). La punktita linio indikas la detektan limon de la detekto. (H) Ĉelliza analizo. FRα-CAR-T aŭ GFP-CAR-T ĉeloj estis agorditaj per adenozino (250μM) aŭ MNA (10 mM) dum 24 horoj, aŭ lasitaj netraktitaj (Ctrl). La procenta mortigo de SK-OV-3 ĉeloj estis mezurita. P-valoro determinita per Welch-t-testo (*P<0.5 kaj **P<0.01).
Por akiri mekanisman komprenon pri MNA-dependa TNFα-esprima reguligo, la ŝanĝoj en TNFα mRNA de MNA-traktitaj T-ĉeloj estis taksitaj (Figuro 5A). Sanaj donacaj T-ĉeloj traktitaj per MNA montris duoblan pliiĝon en TNFα-transskribaj niveloj, indikante ke MNA dependas de TNFα-transskriba reguligo. Por esplori ĉi tiun eblan reguligan mekanismon, du konataj transskribaj faktoroj, kiuj reguligas TNFα, nome aktivigita T-ĉela nuklea faktoro (NFAT) kaj specifa proteino 1 (Sp1), estis taksitaj en respondo al MNA-ligado al la proksimala TNFα-reklamanto (30). La TNFα-reklamanto enhavas 6 identigitajn NFAT-ligejojn kaj 2 Sp1-ligejojn, interkovrantajn ĉe unu loko [-55 bazaj paroj (bp) de la 5'-ĉapo] (30). Kromatina imunoprecipitado (ChIP) montris, ke kiam traktita per MNA, la ligado de Sp1 al la TNFα-reklamanto pliiĝis trioble. La enkorpigo de NFAT ankaŭ pliiĝis kaj alproksimiĝis al graveco (Figuro 5B). Ĉi tiuj datumoj indikas, ke MNA reguligas la esprimon de TNFα per Sp1-transskribo, kaj malpligrade la esprimon de NFAT.
(A) Kompare kun T-ĉeloj kultivitaj sen MNA, la ŝanĝo de TNFα-esprimo en T-ĉeloj traktitaj kun MNA. La esprima padrono per SEM estas montrita (n = 5 sanaj donacantoj). Reprezentas datumojn de almenaŭ n = 3 sendependaj eksperimentoj. (B) La TNFα-reklamanto de T-ĉeloj traktitaj kun aŭ sen 8 mM MNA post kiam NFAT kaj Sp1 estis kombinitaj kun (Ctrl) kaj PMA/ionomicina stimulo dum 4 horoj. Imunoglobulino G (IgG) kaj H3 estis uzitaj kiel negativaj kaj pozitivaj kontroloj por imunoprecipitado, respektive. La kvantigo de ChIP montris, ke la ligado de Sp1 kaj NFAT al la TNFα-reklamanto en MNA-traktitaj ĉeloj pliiĝis plurfoje kompare kun la kontrolo. Reprezentas datumojn de almenaŭ n = 3 sendependaj eksperimentoj. P-valoro determinita per multoblaj t-testoj (*** P <0.01). (C) Kompare kun la ascito de HGSC, T-ĉeloj (ne-citotoksaj) montris pliigitan esprimon de TNF en la tumoro. La koloroj reprezentas malsamajn pacientojn. La montritaj ĉeloj estis hazarde specimenitaj ĝis 300 kaj skuitaj por limigi troŝarĝon (** Padj = 0.0076). (D) Proponita modelo de MNA por ovaria kancero. MNA estas produktita en tumorĉeloj kaj fibroblastoj en TME kaj estas sorbata de T-ĉeloj. MNA pliigas la ligadon de Sp1 al la TNFα-reklamanto, kondukante al pliigita TNFα-transskribo kaj TNFα-citokina produktado. MNA ankaŭ kaŭzas malpliiĝon de IFN-γ. Inhibicio de T-ĉela funkcio kondukas al reduktita mortigkapablo kaj akcelita tumorkresko.
Laŭ raportoj, TNFα havas front- kaj malantaŭ-dependajn kontraŭtumorajn kaj kontraŭtumorajn efikojn, sed ĝi havas bone konatan rolon en antaŭenigado de la kresko kaj metastazo de ovaria kancero (31-33). Laŭ raportoj, la koncentriĝo de TNFα en ascito kaj tumoraj histoj en pacientoj kun ovaria kancero estas pli alta ol tiu en benignaj histoj (34-36). Rilate al mekanismo, TNFα povas reguligi la aktivigon, funkcion kaj proliferadon de blankaj sangoĉeloj, kaj ŝanĝi la fenotipon de kanceraj ĉeloj (37, 38). Konforme al ĉi tiuj trovoj, analizo de diferenciga gena esprimo montris, ke TNF estis signife plireguligita en T-ĉeloj en tumoraj histoj kompare kun ascito (Figuro 5C). La pliiĝo en TNF-esprimo estis evidenta nur en T-ĉelaj populacioj kun ne-citotoksa fenotipo (Figuro S5A). Resumante, ĉi tiuj datumoj subtenas la vidpunkton, ke MNA havas duoblajn imunosupresajn kaj tumor-antaŭenigajn efikojn en HGSC.
Fluoreska markado bazita sur fluocitometrio fariĝis la ĉefa metodo por studi TIL-metabolon. Ĉi tiuj studoj montris, ke kompare kun periferiaj sangaj limfocitoj aŭ T-ĉeloj el sekundaraj limfoidaj organoj, musaj kaj homaj TIL havas pli altan emon al glukoza asimilado (4, 39) kaj laŭgradan perdon de mitokondria funkcio (19, 40). Kvankam ni observis similajn rezultojn en ĉi tiu studo, la ŝlosila evoluo estas kompari la metabolon de tumorĉeloj kaj TIL el la sama rezignita tumora histo. Konforme al kelkaj el ĉi tiuj antaŭaj raportoj, tumoraj (CD45-EpCAM+) ĉeloj el ascito kaj tumoroj havas pli altan glukozan asimiladon ol CD8+ kaj CD4+ T-ĉeloj, subtenante ke la alta glukoza asimilado de tumorĉeloj povas esti komparata kun T-ĉeloj. La koncepto de T-ĉela konkurenco. TME. Tamen, la mitokondria aktiveco de tumorĉeloj estas pli alta ol tiu de CD8+ T-ĉeloj, sed la mitokondria aktiveco estas simila al tiu de CD4+ T-ĉeloj. Ĉi tiuj rezultoj plifortigas la emerĝantan temon, ke oksidativa metabolo estas grava por tumorĉeloj (41, 42). Ili ankaŭ sugestas, ke CD8+ T-ĉeloj povus esti pli sentemaj al oksidativa misfunkcio ol CD4+ T-ĉeloj, aŭ ke CD4+ T-ĉeloj povus uzi karbonajn fontojn krom glukozo por konservi mitokondrian aktivecon (43, 44). Notindas, ke ni observis neniun diferencon en glukoza asimilado aŭ mitokondria aktiveco inter CD4+ T-efektoroj, T-efektoraj memorĉeloj kaj T-centraj memorĉeloj en ascito. Simile, la diferenciĝa stato de CD8+ T-ĉeloj en tumoroj havas nenion komunan kun ŝanĝoj en glukoza asimilado, elstarigante la signifan diferencon inter T-ĉeloj kultivitaj in vitro kaj homaj TIL in vivo (22). Ĉi tiuj observoj ankaŭ estis konfirmitaj per la uzo de senantaŭjuĝa aŭtomata ĉelpopulacia asigno, kiu plue rivelis, ke CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ ĉeloj kun pli alta glukoza asimilado kaj mitokondria aktiveco ol tumorĉeloj estas oftaj sed havas metabolan aktivan ĉelpopulacion. Ĉi tiu populacio povus reprezenti la supozeblan subpopulacion de mieloidaj subpremantaj ĉeloj aŭ plasmacitoidaj dendritaj ĉeloj identigitaj en la scRNA-sekvenca analizo. Kvankam ambaŭ estis raportitaj en homaj ovariaj tumoroj [45], ili ankoraŭ bezonas plian laboron por priskribi ĉi tiun mieloidan subpopulacion.
Kvankam metodoj bazitaj sur fluocitometrio povas klarigi la ĝeneralajn diferencojn en glukozo kaj oksidativa metabolo inter ĉeltipoj, la precizaj metabolitoj produktitaj de glukozo aŭ aliaj karbonfontoj por mitokondria metabolo en TME ankoraŭ ne estas determinitaj. Asigni la ĉeeston aŭ foreston de metabolitoj al difinita TIL-subaro postulas purigon de la ĉelpopulacio el la eltranĉita histo. Tial, nia ĉelriĉiga metodo kombinita kun masspektrometrio povas provizi komprenojn pri la metabolitoj, kiuj estas diference riĉigitaj en T-ĉeloj kaj tumorĉelaj populacioj en kongruaj pacientaj specimenoj. Kvankam ĉi tiu metodo havas avantaĝojn super fluoresk-aktivigita ĉelordigo, certaj metabolitbibliotekoj povas esti trafitaj pro eneca stabileco kaj/aŭ rapida trairorapideco (22). Tamen, nia metodo povis identigi du agnoskitajn imunosupresajn metabolitojn, adenozinon kaj kinureninon, ĉar ili multe varias inter specimentipoj.
Nia metabolomika analizo de tumoroj kaj TIL-subtipoj provizas pli da komprenoj pri la rolo de metabolitoj en ovaria TME. Unue, uzante fluocitometrion, ni determinis, ke ne ekzistis diferenco en mitokondria aktiveco inter tumoroj kaj CD4+ T-ĉeloj. Tamen, LC-MS/MS-analizo rivelis signifajn ŝanĝojn en la abundo de metabolitoj inter ĉi tiuj populacioj, indikante, ke konkludoj pri TIL-metabolo kaj ĝia ĝenerala metabola aktiveco postulas zorgeman interpretadon. Due, MNA estas la metabolito kun la plej granda diferenco inter CD45-ĉeloj kaj T-ĉeloj en ascito, ne tumoroj. Tial, kompartmentigo kaj tumora lokigo povas havi malsamajn efikojn sur TIL-metabolo, kio elstarigas la eblan diversecon en difinita mikromedio. Trie, la esprimo de la MNA-produktanta enzimo NNMT estas ĉefe limigita al CAF, kiu estas tumorĉeloj malpliparte, sed detekteblaj MNA-niveloj estas observataj en tumor-derivitaj T-ĉeloj. La troesprimo de NNMT en ovaria CAF havas konatan kancer-stimulan efikon, parte pro la antaŭenigo de CAF-metabolo, tumora invado kaj metastazo (27). Kvankam la ĝenerala nivelo de TIL estas modera, la esprimo de NNMT en CAF estas proksime rilata al la mezenkima subtipo de la Atlaso de la Kancera Genaro (TCGA), kiu estas asociita kun malbona prognozo (27, 46, 47). Fine, la esprimo de la enzimo AOX1 respondeca pri MNA-degradado ankaŭ estas limigita al la CAF-populacio, kio indikas, ke al T-ĉeloj mankas la kapablo metaboligi MNA. Ĉi tiuj rezultoj subtenas la ideon, ke kvankam plia laboro estas necesa por konfirmi ĉi tiun trovon, altaj niveloj de MNA en T-ĉeloj povas indiki la ĉeeston de imunosupresiva CAF-mikromedio.
Konsiderante la malaltan esprimo-nivelon de MNA-transportiloj kaj la nedetekteblajn nivelojn de ŝlosilaj proteinoj implikitaj en MNA-metabolo, la ĉeesto de MNA en T-ĉeloj estas neatendita. Nek NNMT nek AOX1 povus esti detektitaj per scRNA-sekvenca analizo kaj celita qPCR de du sendependaj kohortoj. Ĉi tiuj rezultoj indikas, ke MNA ne estas sintezita de T-ĉeloj, sed absorbita de ĉirkaŭa TME. In vitro eksperimentoj montras, ke T-ĉeloj emas akumuli eksogenan MNA.
Niaj in vitro studoj montris, ke eksogena MNA induktas la esprimon de TNFα en T-ĉeloj kaj plifortigas la ligadon de Sp1 al la TNFα-reklamanto. Kvankam TNFα havas kaj kontraŭtumorajn kaj kontraŭtumorajn funkciojn, en ovaria kancero, TNFα povas antaŭenigi la kreskon de ovaria kancero (31-33). La neŭtraligo de TNFα en ovaria tumorĉelkulturo aŭ la elimino de TNFα-signalo en musmodeloj povas plibonigi TNFα-mediaciitan inflaman citokinan produktadon kaj inhibicii tumorkreskon (32, 35). Tial, en ĉi tiu kazo, TME-derivita MNA povas agi kiel proinflama metabolito per TNFα-dependa mekanismo tra la aŭtokrina buklo, tiel antaŭenigante la okazon kaj disvastiĝon de ovaria kancero (31). Surbaze de ĉi tiu ebleco, TNFα-blokado estas studata kiel ebla terapia agento por ovaria kancero (37, 48, 49). Krome, MNA difektas la citotoksecon de CAR-T-ĉeloj al ovariaj tumorĉeloj, provizante plian pruvon por MNA-mediaciita imunsubpremado. Kolektive, ĉi tiuj rezultoj sugestas modelon, en kiu tumoroj kaj CAF-ĉeloj sekrecias MNA en eksterĉelan TME. Per (i) TNF-induktita stimulo de ovaria kancera kresko kaj (ii) MNA-induktita inhibicio de citotoksa agado de T-ĉeloj, ĉi tio povus havi duoblan tumoran efikon (Figuro 5D).
Konklude, per apliko de kombinaĵo de rapida ĉelriĉigo, unuĉela sekvencado kaj metabola profilado, ĉi tiu studo rivelis la grandegajn imunometabolomikajn diferencojn inter tumoroj kaj ascitĉeloj en HGSC-pacientoj. Ĉi tiu ampleksa analizo montris, ke ekzistas diferencoj en glukoza asimilado kaj mitokondria agado inter T-ĉeloj, kaj identigis MNA kiel ne-ĉelan sendependan imunreguligan metaboliton. Ĉi tiuj datumoj havas efikon sur kiel TME influas T-ĉelan metabolon en homaj kanceroj. Kvankam la rekta konkurenco pri nutraĵoj inter T-ĉeloj kaj kanceraj ĉeloj estis raportita, metabolitoj ankaŭ povas agi kiel nerektaj reguligantoj por antaŭenigi tumorprogresadon kaj eble subpremi endogenajn imunrespondojn. La plia priskribo de la funkcia rolo de ĉi tiuj reguligaj metabolitoj povus malfermi alternativajn strategiojn por plifortigi la kontraŭtumoran imunrespondon.
Pacientaj specimenoj kaj klinikaj datumoj estis akiritaj per la deponejo de kancero-tumoro-histo en Brita Kolumbio, atestita de la Kanada Reto de Histaj Deponejoj. Laŭ la protokolo aprobita de la BC Cancer Research Ethics Committee kaj la Universitato de Brita Kolumbio (H07-00463), ĉiuj specimenoj kaj klinikaj datumoj de pacientoj akiris informitan skriban konsenton aŭ formale rezignis pri sia konsento. La specimenoj estas konservitaj en la atestita BioBanko (BRC-00290). Detalaj karakterizaĵoj de la pacientoj estas montritaj en Tabeloj S1 kaj S5. Por kriokonservado, skalpelo estas uzata por meĥanike malkomponi la tumorspecimenon de la paciento kaj poste puŝi ĝin tra 100-mikrometra filtrilo por akiri unuopan ĉelsuspendon. La ascito de la paciento estis centrifugita je 1500 rpm dum 10 minutoj je 4°C por peli la ĉelojn kaj forigi la supernatant. Ĉeloj akiritaj el tumoro kaj ascito estis kriokonservitaj en 50% varmo-inaktivigita homa AB-serumo (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) kaj 10% dimetilsulfoksido. Ĉi tiuj konservitaj unuĉelaj suspendoj estis degelitaj kaj uzitaj por metabolomiko kaj metabolit-determinado priskribita sube.
La kompleta medio konsistas el 0,22 μm filtrita 50:50 suplementita per RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamino (Thermo Fisher Scientific) suplementita per 10% varmo-inaktivigita homa AB-serumo (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamino (Thermo Fisher Scientific) (Fisher Scientific), 1 x Penicilina Streptomicina (PenStrep) solvaĵo (Thermo Fisher Scientific) kaj 50 μMB-merkaptoetanolo. AimV (Invitrogen) estas suplementita per 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) kaj 2 mM l-glutamino (Thermo Fisher Scientific). La fluocitometra tinktura bufro konsistis el 0,22 μm filtrita fosfato-bufrita salakvo (PBS; Invitrogen) suplementita per 3% varmo-inaktivigita AB-homa serumo (Sigma). La ĉelriĉiga bufro konsistas el 0,22 μm filtrita PBS kaj suplementita per 0,5% varmo-inaktivigita homa AB-serumo (Sigma-Aldrich).
En kompleta medio je 37°C, la ĉeloj estis koloritaj per 10 nM MT DR kaj 100 μM 2-NBDG dum 30 minutoj. Poste, la ĉeloj estis koloritaj per vivebleca tinkturfarbo eF506 je 4°C dum 15 minutoj. Resuspendu la ĉelojn en FC Block (eBioscience) kaj Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), diluu en fluocitometra koloriga bufro (laŭ la instrukcioj de la fabrikanto), kaj inkubu dum 10 minutoj je ĉambra temperaturo. Kolorigu la ĉelojn per aro da antikorpoj (Tabelo S2) en fluocitometra koloriga bufro je 4°C dum 20 minutoj. Resuspendu la ĉelojn en fluocitometra koloriga bufro (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfiguracio) antaŭ analizo. Uzu SpectroFlo kaj FlowJo V10 por analizi ĉelkalkulajn datumojn, kaj uzu GraphPad Prism 8 por krei la datumojn. La mediana fluoreska intenseco (MFI) de 2-NBDG kaj MT DR estis log-normaligita, kaj poste parigita t-testo estis uzata por statistika analizo por konsideri kongruajn pacientojn. Forigu ĉiujn populaciojn kun malpli ol 40 okazaĵoj el la analizo; enigu MFI-valoron de 1 por iuj ajn negativaj valoroj antaŭ ol plenumi statistikan analizon kaj datenbildigon.
Por kompletigi la manan strategion de limigo de la supra procezpanelo, ni uzis la plenan komentadon per la forma limigarbo (FAUST) (21) por aŭtomate asigni ĉelojn al la populacio post eliminado de mortaj ĉeloj en FlowJo. Ni mane administras la rezulton por kunfandi populaciojn, kiuj ŝajnas esti misasignitaj (kombinante PD1+ kun PD1-tumoraj ĉeloj) kaj retenitajn populaciojn. Ĉiu specimeno enhavas averaĝe pli ol 2% da ĉeloj, por entute 11 populacioj.
Centrifugado per Fikol-gradienta denseco estis uzata por apartigi PBMC-ojn de leŭkocitaj apartigproduktoj (STEMCELL Technologies). CD8+ T-ĉeloj estis izolitaj de PBMC uzante CD8-Mikroperlojn (Miltenyi) kaj ekspansiigitaj en kompleta medio uzante TransAct (Miltenyi) dum 2 semajnoj laŭ la instrukcioj de la fabrikanto. La ĉeloj estis lasitaj stari dum 5 tagoj en kompleta medio enhavanta IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), kaj poste restimulitaj per TransAct. En la 7-a tago, laŭ la instrukcioj de la fabrikanto, homaj CD45-Mikroperloj (Miltenyi) estis uzataj por riĉigi ĉelojn en tri sinsekvaj raŭndoj. La ĉeloj estis alikvotitaj por fluocitometria analizo (kiel priskribite supre), kaj unu miliono da ĉeloj estis alikvotitaj tri fojojn por LC-MS/MS-analizo. La specimenoj estis prilaboritaj per LC-MS/MS kiel priskribite sube. Ni taksis la mankantan metabolitan valoron kun jonnombro de 1,000. Ĉiu specimeno estas normigita per la totala jonnombro (TIC), logaritme konvertita kaj aŭtomate normigita en MetaboAnalystR antaŭ analizo.
La unuopa ĉelsuspendo de ĉiu paciento estis degelita kaj filtrita tra 40 μm filtrilo en kompletan medion (kiel priskribite supre). Laŭ la protokolo de la fabrikanto, tri sinsekvaj raŭndoj de pozitiva selektado per magneta globetapartigo uzante MicroBeads (Miltenyi) estis uzitaj por riĉigi la specimenojn por CD8+, CD4+ kaj CD45- ĉeloj (sur glacio). Mallonge, la ĉeloj estas resuspenditaj en ĉelriĉiga bufro (kiel priskribite supre) kaj kalkulitaj. La ĉeloj estis inkubaciitaj kun homaj CD8-globetoj, homaj CD4-globetoj aŭ homaj CD45-globetoj (Miltenyi) je 4°C dum 15 minutoj, kaj poste lavitaj per ĉelriĉiga bufro. La specimeno estas pasigita tra la LS-kolono (Miltenyi), kaj la pozitivaj kaj negativaj frakcioj estas kolektitaj. Por redukti la daŭron kaj maksimumigi la ĉelresaniĝan paŝon, la CD8-frakcio estas tiam uzata por la dua raŭndo de CD4+ riĉigo, kaj la CD4-frakcio estas uzata por la posta CD45-riĉigo. Konservu la solvaĵon sur glacio dum la tuta apartigprocezo.
Por prepari specimenojn por analizo de metabolitoj, la ĉeloj estis lavitaj unufoje per glacie malvarma salsolvaĵo, kaj 1 ml da 80%-a metanolo estis aldonita al ĉiu specimeno, poste kirlite kaj rapide frostigita en likva nitrogeno. La specimenoj estis submetitaj al tri frostig-degelaj cikloj kaj centrifugitaj je 14 000 rpm dum 15 minutoj je 4 °C. La supernatant enhavanta la metabolitojn estas vaporigita ĝis sekiĝo. La metabolitoj estis redissolvitaj en 50 μl da 0,03%-a formika acido, kirlite por miksi, kaj poste centrifugitaj por forigi derompaĵojn.
Ekstraktu metabolitojn kiel priskribite supre. Translokigu la supernatant al alt-efikeca likva kromatografia botelo por metabolomika esplorado. Uzu hazardan traktadprotokolon por trakti ĉiun specimenon per simila nombro da ĉeloj por malhelpi aro-efikojn. Ni plenumis kvalitan takson de tutmondaj metabolitoj antaŭe publikigitaj sur la AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Kromatografia analizo kaj pintarea integriĝo estis faritaj uzante MultiQuant versio 2.1 programaron (Applied Biosystems SCIEX).
Jona kalkulo de 1000 estis uzata por taksi la mankantan metabolitan valoron, kaj la TIC de ĉiu specimeno estis uzata por kalkuli la normigitan pintareon de ĉiu detektita metabolito por korekti ŝanĝojn enkondukitajn de la instrumenta analizo de specimenprilaborado. Post kiam TIC estas normigita, MetaboAnalystR(51) (defaŭlta parametro) estas uzata por logaritma konverto kaj aŭtomata normlinia skalado. Ni uzis PCA kun vegana R-pakaĵo por plenumi esploran analizon de metabolomaj diferencoj inter specimentipoj, kaj uzis partan redundancan analizon por analizi pacientojn. Ni uzis la metodon de Ward por konstrui varmomapan dendrogramon por grupigi la eŭklidan distancon inter specimenoj. Ni uzis limma (52) sur normigita metabolita abundeco por identigi diference abundajn metabolitojn tra la tuta ĉeltipo kaj mikromedio. Por simpligi la klarigon, ni uzas la grupan meznombran parametron por specifi la modelon, kaj konsideras la ĉeltipojn en la mikromedio kiel ĉiun grupon (n = 6 grupoj); por la signiftesto, ni plenumis tri ripetajn mezuradojn por ĉiu metabolito. Por eviti falsan replikadon, la paciento estis inkludita kiel obstaklo en la limma-dezajno. Por kontroli la diferencojn en metabolitoj inter malsamaj pacientoj, ni adaptis la limma-modelon inkluzivante pacientojn laŭ fiksa maniero. Ni raportas la signifon de la antaŭdifinita kontrasto inter la ĉeltipo kaj la mikromedio de Padj <0.05 (Benjamini-Hochberg-korekto).
Post viglecriĉigo uzante la Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viveco), unuĉela transkriptoma sekvencado estis efektivigita sur la totalaj vivaj frostaj ascitoj kaj tumoraj specimenoj uzante 10x 5′ genan espriman protokolon. Kvin kazoj kun kongruaj tumoroj kaj ascitoj estis analizitaj, kvankam la malalta viveco de unu tumora specimeno malhelpis ĝian inkludon. Por atingi plurajn selektadojn de pacientoj, ni kombinis la specimenojn de ĉiu paciento en la lenoj de la 10x kroma regilo, kaj analizis la ascitojn kaj tumorlokojn aparte. Post sekvencado [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp parigita fino (PE), Kebekia genaro; Kun averaĝo de 73 488 kaj 41 378 legaĵoj por ĉelo por tumoro kaj ascito respektive]], ni uzis CellSNP kaj Vireo (53) (bazitaj sur CellSNP kiel La komuna homa SNP (VCF) provizita de GRCh38 ricevas donacantan identecon. Ni uzas SNPRelate por dedukti la plej proksiman identecon (IBS) de la genotipa stato (IBS) de la paciento, ekskludante neasignitajn ĉelojn kaj ĉelojn identigitajn kiel dupleksojn kaj kongruigante donacantojn inter ascito kaj tumoraj specimenoj (54). Surbaze de ĉi tiu tasko, ni retenis tri kazojn kun abunda ĉelreprezentado en la tumoro kaj ascito por posta analizo. Post plenumado de amasa filtrado en la disigilo (55) kaj skrapilo (56) BioConductor-pakaĵoj, ĉi tio rezultigis 6975 ĉelojn (2792 kaj 4183 ĉeloj el tumoro kaj ascito, respektive) por analizo. Ni uzas la Louvain-agregacion de igraph (57) de komuna plej proksima najbara reto (SNN) bazita sur la distanco de Jaccard al aretaj ĉeloj per esprimo. La aretoj estis mane prinotitaj al supozeblaj ĉeltipoj surbaze de esprimo de markilgenoj kaj bildigitaj per t-SNE. Citotoksaj T-ĉeloj estas difinitaj per la esprimo de CD8A kaj GZMA, ekskludante subaretojn kun malalta ribosoma proteina esprimo. Ni aliris la publikigitajn datumojn de Izar et al. (16), inkluzive de ilia t-SNE-enkorpigo, povas kontroli la espriman interkovron inter imunĉelaj markiloj kaj NNMT-esprimo.
PBMC-oj estis apartigitaj de leŭkocitaj apartigproduktoj (STEMCELL Technologies) per Fikol-gradienta denseca centrifugado. CD3+ ĉeloj estis izolitaj de PBMC uzante CD3-perlojn (Miltenyi). Ĉeestante aŭ forestante MNA, CD3+ ĉeloj estis aktivigitaj per plat-ligita CD3 (5μg/ml), solvebla CD28 (3μg/ml) kaj IL-2 (300 U/ml; Proleukin). En la lasta tago de ekspansio, la viveblo (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) kaj proliferado (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) estis taksitaj per fluocitometrio. Taksu la funkcion de la efektoro stimulante ĉelojn per PMA (20 ng/ml) kaj ionomicino (1 μg/ml) per GolgiStop dum 4 horoj, kaj monitoru CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) kaj TNFα-fluorescein-izotiocianato (FITC) (MAb11, BD). Stimulu qPCR kaj ChIP-ĉelojn per PMA (20 ng/ml) kaj ionomicino (1 μg/ml) dum 4 horoj. La ELISA-supernatant estis kolektita antaŭ kaj post stimulo per PMA (20 ng/ml) kaj ionomicino (1 μg/ml) dum 4 horoj.
Sekvu la protokolon de la fabrikanto por izoli RNA-on uzante RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Uzu QIAshredder (QIAGEN) por homogenigi la specimenon. Uzu alt-kapacitan RNA-al-cDNA-ilaron (Thermo Fisher Scientific) por sintezi komplementan DNA-on (cDNA). Uzu TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) por kvantigi genan esprimon (laŭ la protokolo de la fabrikanto) per la jenaj sondiloj: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliceraldehido-3-fosfato de Hidrogeno (GAPDH)] kaj Hs01010726_m1 (SLC22A2). La specimenoj estis prilaboritaj per la StepOnePlus realtempa PCR-sistemo (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) en la MicroAmp rapida optika 96-puta reakcia plato (Applied Biosystems) kun MicroAmp optika filmo. Ĉiu Ct-valoro, kiu superas 35, estas konsiderata super la detekta sojlo kaj estas markita kiel nedetektebla.
Faru ChIP kiel antaŭe priskribite (58). Mallonge, la ĉeloj estis traktitaj per formaldehido (fina koncentriĝo 1.42%) kaj inkubaciitaj je ĉambra temperaturo dum 10 minutoj. Uzu suplementitan ŝveliĝan bufron (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl kaj 0.1% NP-40) sur glacio dum 10 minutoj, poste resuspendu en imunoprecipita bufro kiel priskribite (58). La specimeno estis poste sonikita per la jenaj cikloj: 10 cikloj (20 1-sekundaj pulsoj) kaj statika tempo de 40 sekundoj. Inkubu ChIP-gradan imunoglobulinon G (Cell Signaling Technology; 1μl), histonon H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) kaj SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) antikorpojn kun la specimeno je 4°CC, skuu dumnokte. Inkubu protein-A-perlojn (Thermo Fisher Scientific) kun la specimeno je 4°C kun milda skuado dum 1 horo, poste uzu chelex-perlojn (Bio-Rad) por riĉigi la DNA-on, kaj uzu proteinazon K (Thermo Fisher) por proteina digestado. TNFα-promotoro estis detektita per PCR: antaŭen, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; male, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp produkto). La bildojn produktis Image Lab (Bio-Rad) kaj kvantigis uzante la programaron ImageJ.
La ĉelkultura supernatanto estis kolektita kiel priskribite supre. La determinado estis efektivigita laŭ la proceduroj de la fabrikanto por homa TNFα ELISA-ilaro (Invitrogen), homa IL-2 ELISA-ilaro (Invitrogen) kaj homa IFN-γ ELISA-ilaro (Abcam). Laŭ la protokolo de la fabrikanto, la supernatanto estis diluita 1:100 por detekti TNFα kaj IL-2, kaj 1:3 por detekti IFN-γ. Uzu EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) por mezuri absorbancon je 450 nm.
PBMC-oj estis apartigitaj de leŭkocitaj apartigproduktoj (STEMCELL Technologies) per Fikol-gradienta denseca centrifugado. CD3+ ĉeloj estis izolitaj de PBMC uzante CD3-perlojn (Miltenyi). Ĉeestante aŭ forestante MNA, CD3+ ĉeloj estis aktivigitaj per plat-ligita CD3 (5μg/ml), solvebla CD28 (3μg/ml) kaj IL-2 (300 U/ml; Proleukin) dum 3 tagoj. Post 3 tagoj, la ĉeloj estis kolektitaj kaj lavitaj per 0.9% salakvo, kaj la precipitaĵo estis rapide frostigita. Ĉelnombrado estis farita per fluocitometrio (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfiguracio) uzante 123-kalkulitajn eBead-ojn.
Ekstraktu metabolitojn kiel priskribite supre. La sekigita ekstrakto estis rekonstruita je koncentriĝo de 4000 ĉelekvivalentoj/μl. Analizu la specimenon per inversfaza kromatografio (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornio) kaj CORTECS T3 kolumno (2,1×150 mm, partikla grandeco 1,6-μm, pora grandeco 120-Å; #186008500, Waters). Polusa masspektrometro (6470, Agilent), en kiu elektroŝpruca jonigo funkcias en pozitiva reĝimo. Mova fazo A estas 0,1% formika acido (en H2O), movebla fazo B estas 90% acetonitrilo, 0,1% formika acido. La LC-gradiento estas 0 ĝis 2 minutoj por 100% A, 2 ĝis 7,1 minutoj por 99% B, kaj 7,1 ĝis 8 minutoj por 99% B. Poste reekvilibrigu la kolonon kun la movebla fazo A je flukvanto de 0,6 ml/min dum 3 minutoj. La flukvanto estas 0,4 ml/min, kaj la kolona ĉambro estas varmigita ĝis 50 °C. Uzu la puran kemian normon de MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, Norda Jorko, Ontario, Kanado) por establi retentempon (RT) kaj transformon (RT = 0,882 minutoj, transformo 1 = 137→94,1, transformo 2 = 137→92, Konverto 3 = 137→78). Kiam ĉiuj tri transiroj okazas je la ĝusta retentempo, transiro 1 estas uzata por kvantigo por certigi specifecon. La norma kurbo de MNA (Toronto Research Chemical Company) estis generita per ses seriaj diluoj de la baza solvaĵo (1 mg/ml) por akiri normojn de 0,1, 1,0, 10 kaj 100 ng/ml kaj 1,0 kaj 10 μg/ml respektive likvaĵo. La detektolimo estas 1 ng/ml, kaj la lineara respondo estas inter 10 ng/ml kaj 10 μg/ml. Ĉiu injekto de du mikrolitroj da specimeno kaj normo estas uzata por LC/MS-analizo, kaj miksita kvalitkontrola specimeno estas funkciigita ĉiujn ok injektojn por certigi la stabilecon de la analiza platformo. La MNA-respondoj de ĉiuj MNA-traktitaj ĉelspecimenoj estis ene de la lineara intervalo de la analizo. Datenanalizo estis farita uzante la kvantan analizan programaron MassHunter (v9.0, Agilent).
La duageneracia αFR-CAR-konstrukcio estis prenita de Song et al. (59). Mallonge, la konstrukcio enhavas la jenan enhavon: CD8a gvidan sekvencon, homan αFR-specifan unuĉenan varian fragmenton, CD8a ĉarniron kaj transmembranan regionon, CD27 intraĉelan domajnon kaj CD3z intraĉelan domajnon. La kompleta CAR-sekvenco estis sintezita per GenScript, kaj poste klonita en la duageneracian lentivirusan esprimvektoron antaŭ la GFP-esprimkaseto uzata por taksi la transduktan efikecon.
Lentiviruso estas produktita per transfekto de HEK293T-ĉeloj [Amerika Tipa Kulturkolekto (ATCC)]; kreskigitaj en Dulbecco-modifita Eagle-medio enhavanta 10% fetan bovan serumon (FBS) kaj 1% PenStrep, kaj uzante CAR-GFP-vektoron. La enpakigaj plasmidoj (psPAX2 kaj pMD2.G, Addgene) uzas lipofektan aminon (Sigma-Aldrich). La virus-entenanta supernatanto estis kolektita 48 kaj 72 horojn post transfekto, filtrita, kaj koncentrita per ultracentrifugado. Konservu la koncentritan virusan supernatanton je -80°C ĝis transdukto.
PBMC-oj estas apartigitaj de apartigproduktoj de sanaj donacantaj leŭkocitaj ĉeloj (STEMCELL Technologies) per Fikol-gradienta denseca centrifugado. Uzu pozitivajn selektajn CD8-mikroperlojn (Miltenyi) por izoli CD8+ ĉelojn de PBMC. Stimulu T-ĉelojn per TransAct (Miltenyi) kaj en TexMACS-medio [Miltenyi; suplementita per 3% varmo-inaktivigita homa serumo, 1% PenStrep kaj IL-2 (300 U/ml)]. Dudek kvar horojn post stimulo, T-ĉeloj estis transduktitaj per lentiviruso (10 μl da koncentrita virusa supernatanto por 10⁶ ĉeloj). 1 ĝis 3 tagojn post transdukto sur Cytek Aurora (sur FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), taksu la GFP-esprimon de la ĉeloj por montri transduktan efikecon de almenaŭ 30%.
CAR-T-ĉeloj estis kultivitaj dum 24 horoj en Immunocult (STEMCELL Technologies; suplementita per 1% PenStrep) sub la jenaj kondiĉoj: netraktita, traktita per 250 μM adenozino aŭ 10 mM MNA. Post antaŭtraktado, CAR-T-ĉeloj estis lavitaj per PBS kaj kombinitaj kun 20,000 SK-OV-3-ĉeloj [ATCC; en McCoy 5A-medio (Sigma-Aldrich) suplementita per 10% FBS kaj 1% PenStrep je 10°C: La rilatumo inter efektoro kaj celo de 1 estis amplifikita trioble en suplementita Immunocult-medio. SK-OV-3-ĉeloj kaj SK-OV-3-ĉeloj lizitaj per digitalisaponino (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) estis uzitaj kiel negativaj kaj pozitivaj kontroloj, respektive. Post 24 horoj da kunkultivado, la supernatanto estis kolektita kaj la laktata dehidrogenazo (LDH) estis mezurita laŭ la instrukcioj de la fabrikanto (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). La LDH-supernatanto estis diluita 1:50 en LDH-bufro. La procento de mortigo estis mezurita uzante la jenan formulon: procento de mortigo = procento de korekto / maksimuma mortigofteco x 100%, kie procento de korekto = kunkultivado - nur T-ĉeloj, kaj maksimuma mortigofteco = pozitiva kontrolo - negativa kontrolo.
Kiel priskribite en la teksto aŭ materialoj kaj metodoj, uzu GraphPad Prism 8, Microsoft Excel aŭ R v3.6.0 por statistika analizo. Se pluraj specimenoj estas kolektitaj de la sama paciento (kiel ekzemple ascito kaj tumoro), ni uzas parigitan t-teston aŭ inkluzivas la pacienton kiel hazardan efikon en lineara aŭ ĝeneraligita modelo laŭbezone. Por metabolomika analizo, la gravecotesto estas farita trioble.
Por suplementaj materialoj por ĉi tiu artikolo, bonvolu vidi http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Ĉi tiu estas artikolo kun libera aliro, distribuita laŭ la kondiĉoj de la permesilo Krea Komunaĵo Atribuite-Nekomerce, kiu permesas la uzon, distribuon kaj reproduktadon en iu ajn medio, kondiĉe ke la fina uzo ne estas por komerca profito kaj la premiso estas, ke la originala verko estas ĝusta. Referenco.
Noto: Ni nur petas vin provizi vian retpoŝtadreson por ke la persono, kiun vi rekomendas al la paĝo, sciu, ke vi volas, ke ili vidu la retpoŝton kaj ke ĝi ne estas spamo. Ni ne kaptos iujn ajn retpoŝtadresojn.
Ĉi tiu demando estas uzata por testi ĉu vi estas vizitanto kaj malhelpi aŭtomatan spam-sendon.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini G.Russell Jones (Ralph J.Russell), Ralph J. De Bellardini (R. G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA kontribuas al la imunsubpremado de T-ĉeloj kaj reprezentas eblan imunoterapian celon por la traktado de homa kancero.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini G.Russell Jones (Ralph J.Russell), Ralph J. De Bellardini (R. G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA kontribuas al la imunsubpremado de T-ĉeloj kaj reprezentas eblan imunoterapian celon por la traktado de homa kancero.
©2021 Amerika Asocio por la Akcelo de Scienco. ĉiuj rajtoj rezervitaj. AAAS estas partnero de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef kaj COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.